Spermin oosit içine mikroenjeksiyonu infertilite tedavisinde bir dönüm noktası olmuşsa de, bu tekniğin başarısı %30-50 arasında değişmektedir. Başarısız kalınan olgularda spermatozoa ile oosit arasında fizyolojik şartlarda olması gereken bazı etkileşimlerin by-pass edilmiş olması mümkündür. Ovumda mayoz II’nin tamamlanması spermatozoa membranının ovumu çevreleyen membran yapılarıyla teması neticesi olmaktadır. Son yıllarda sperm mebranının fertilizasyonda çok önemli rolü olduğu anlaşılmıştır.Spermatozoanın yüzeyinde çok sayıda madde bulunur. Bunların bir kısmı seminal plazmadan gelirken diğerleri membranın kendi yapısın aittir . Seminal sıvıdan gelen bazı faktörler iyi tanımlanmışlardır: spermin kapasitasyonu sırasında kadın genital sisteminde ortamdan uzaklaştırılan dekapasitasyon faktörü, proteinaz inhibitörleri ve laktoferrin bunlar arasındadır.
Spermatozoanın yapısı ve fonksiyonları üzerinde önemli rolü bulunan sperm plazma membranı genel olarak diğer memeli hücre membranları ile benzerlik gösterir. Sperm membranının önemi spermatozoanın oositi çevreleyen membranlara yapışmasındaki rolünün yanı sıra spermatozoanın genetik materyali ile membran yapısı arasında belli bir ilişkinin bulunması tartışmasından kaynaklanmaktadır. Eğer genetik materyaldeki defektler sperm morfolojisindeki bozulma ile anlaşılabilirse, teratozoospermik olgularda gerek IVF-ET gerekse ICSI uygulamalarını takiben fertilizasyon yetmezliği daha açık izah edilebilir. Son yıllarda hücre iskeleti ve bunun nukleus ve ekstrasellüler matriks elemanları ile olan ilişkileri üzerinde çalışmalar yoğunlaşmıştır.
Sperm membranının yapısı protein, lipid ve karbonhidratlar olmak üzere 3 esas yapı elemanından meydana gelen lipoglikoproteinlerden oluşmuştur. Her nekadar spermatozoa bazen enerji kaynağı olarak kendi fosfolipid kaynaklarını kullanırsa da, lipidlerin esas görevi membran yapısını oluşturmak ve stabilizasyonunu sağlamaktır. İnsan spermatozoası yüksek oranda phosphatidil choline, phosphatidyl ethanol-amine ve sphingomyelin içerir. Total yağ asitleri fraksiyonunun yaklaşık %45’ini phospholipidlere bağlı polyunsature yağ asitleri oluşturur. Predominant sature yağ asiti palmitic asit ve predominant aldehid ise palmitaldehyde ‘dir. Fosfolipidlerle birlikte kolesterol sperm membranının bütünlüğünü ve impermeabilitesini sağlar. Sperm membranının yapısında lipidlerin yanısıra mannoz ve glükoz monosakkaridleri ile disakkaridler bulunur. Tirozin, triptofan ve histidin esas aminoasit yapısını oluşturur.
Trübner ve ark. sperm membran proteinleri ile ilgili geniş bir literatür taraması yapmıştır. Buna göre spermatozoa membranında spesifik antijenler (tirozin kinaz sp 95, proakrozin, PH-20, PH-30, sp 56, galaktoziltransferaz, spermadezinler, progesteron reseptörü) ve başka somatik dokularda da bulunabilen, hücre-hücre yada hücre-matriks etkileşimini yürüten nonspesifik proteinler, veya matriks proteinleri, (kollagen, fibronektin, laminin, adezyon molekülleri) olmak üzere iki grup madde yer alır. Adezyon molekülleri 4 grupta incelenebilir: immünoglobülinler, cadherinler, selektinler ve integrinler. Hücre yüzeyinde bulunan membran reseptörleri plazma membranından dışarı doğru uzanırlar ve hücre iskelet sistemi ile ekstrasellüler matrixde bulunan proteinler arasında direk bir köprü oluştururlar. Bu transmembran reseptörlerine integrinler denir. İntegrinlerin 2 subüniti bulunur: alfa ve beta. Özellikle ekstrasellüler matriksde bulunan ve integrinlere bağlanan bazı matriks proteinleri fibronektin, laminin, kollagen IV, glikozaminoglikanlar ve vibronektin’dir. Spermatozoa-ovum ilişkisinde matriks proteinleri ile integrinlerin ilişkisi geniş çapta araştırlmıştır. Hücrenin iç kompartmanına doğru uazanan kısımlarıyla integrinler hücre iskeletinin yapısı ve organizasyonunda görev alır. Ayrıca başka transmembran reseptör tipleri de hücre dışına uzanarak uygun reseptörlerle direk ilikide bulunmaktadırlar. Bu matriks sistemi hücre içi vedışı arasında yapısal bir ağ oluşturarak fonksiyonlarında önem kazanır: (1) hücre dışında matriks ve diğer hücreler ile bağlantı kurarak; (2) hücre içinde hücrenin iskelet sisteminin organizasyonuna katılarak; ve (3) nükleer matriks ve DNA ile bağlanarak bütün bu sistemler arasında bir aracılık yapar. Dolayısıyla hücre dışı ortam bir çok yönüyle DNA fonksiyonlarının regülasyonunda, hücrenin gelişmesi ve diferansiasyonunda görev alır.
Farklı vücut dokularında bulunan hücrelerde DNA benzer olmakla birlikte, DNA’nın 3 boyutlu konumu farklı hücre tiplerinde farklılıklar gösterebilir. DNA’nın bu şekilde yapısal farklılıklar gösterebilmesi nükleer matriks denen bir sistem tarafından kontrol edilmektedir. Nukleusun yapısal komponentlerinin DNA’yı farklı topolojik yönlendirmelere tabi tutarak spesifik reseptör etkileşimlerine olanak sağladıkları ortaya konmuştur. DNA topolojisindeki bu yapısal değişikliklerin diferansiasyonda esas olduğu bilinmektedir. Nükleer matriks kromozom iskeleti ile benzer bazı proteinlere sahiptir. DNA topolojisini idare eden topoizomeraz II enzimi hem nükleer matris hem de kromozom iskeleti ile ilişkilidir. Dolayısıyla matriks kromatinin yapısını düzenler. Nükleer matriks hormon reseptör komplekslerini bağlayarak aktif genlerin lokalizasyonunu da idare eder. Bir diğer ifadeyle nükleer matriks DNA luplarının fonksiyonel organizasyonunu ayarlayarak nükleik asitlerin spesifik kontrolü için belirli lokalizasyonlar sağlayan, nukleusun dinamik yapısal bir subkomponentidir. Nükleer matriks rezidü nükleer elementler, rezidü nukleolus ve ribonukleoproteinler’in dinamik fibröz protein kafesine bağlanması ile meydana gelmiş bir ağ yapısıdır. Nükleer matrikste steroid hormon reseptörlerinin bağlanacakları özel bölgeler vardır. Bu şekilde nükleer matriks transformasyon proteinlerinin sentezlenmesi için bir hedef rolü de taşımış olur.
Hücrelerin sitomatriksi yani sitoplazmik iskeleti nükleer matrikse direk olarak bağlanmaktadır. Bu sitomatriksi mikrotübililer, mikrofilamentler ve intermediate filamentler oluşturur. Dolayısıyla matriks sistemi ile DNA ve plazma membranı arasında direk bir yapısal bağlantı kurulmuştur. Sitomatriks aynı zamanda hücre dışı ortam ile de bağlantı yapar.
Floresan mikroskopisi ile yapılan çalışmalarda adezyon molekülleri’nin spermatozoa yüzeyinde lokalizasyonları analiz edilmiştir. Sperm yüzeyinde kollagen IV, alfa1 ve alfa2 integrinlere ait ekspresyonlar bulunamamıştır. Laminin akrozomal membranda, fibronektin ve beta4 integrin ise esasen ekvatoral membranda bulunmuştur. Fibronektin, alfa3,4,5 ve beta1 integrinler akrozomal ve ekvatoral membranda tespit edilmişlerdir. Laminin ve alfa4 integrin postakrozoaml ve az miktarda akrozomal bölgede bulunmuştur. Beta2 integrinler, vibronektin, alfa5 ve beta3 reseptörlerine ise postakrozomal lokalizasyonda rastlanılmıştır.
Sperm üzerinde hücre adezyon moleküllerinin özellikle integrinlerin gametlerin bağlanmasında önemli rolleri vardır. Adezyon moleküllerinin kaynağı iki yer olabilir: Spermatogenez sırasında sperm tarafından kazanılmış olabilirler veya seminal plazmadan gelebilirler. Adezyon moleküllerine ait patolojiler spermin fertilizasyon kapasitesini önemli ölçüde etkileyebilmektedir. Dolayısıyla membran yapısı, spermatogenez ve fertilizasyon potansiyeli arasında yakın ilgi bulunmaktadır. Spermatogenez, ejakülasyon, kapasitasyon, korona ve zona’nın penetrasyonları sırasında çok sayıda adezyon molekülleri faaliyet gösterir. Hangi adezyon moleküllerinin fertilizasyonda önemli oldukları ise henüz kesinlik kazanmamıştır.
Sperm-oosit etkileşiminde ekvatoral membran temas ve füzyon yeri olarak oldukça öneme sahiptir. Esas olarak burada bulunan fibronektin, alfa5 ve beta4 integrinler bu bakımdan önem kazanırlar. Alfa3, 4 integrinler ve laminin ise buraya ek olarak akrozomal membranda da lokalizedirler.
Spermin maturasyonu ve kapasitasyonu sırasında plazma membranında kompleks bir yeniden yapılanma görülür. Buda spermin ovumu çevreleyen zona pellusida ile temas etmesine ve akrozom reaksiyonunun gelişerek bazı maddelerin ekzositozuna olanak sağlar. Akrozom reaksiyonu sperm plazma membranı ile dış akrozom membranının füzyonu neticesi gerçekleşir. Yapılan çalışmalar göstermiştirki spermin maturasyonu, hiperaktivasyonu ve kapasitasyonu sırasında membran lipidlerinin akıcılığı artmaktadır. Eksperimental çalışmalarda akrozom reaksiyonu geçiren spermde yüzey transmembran proteinlerinin apikal kenara ve ekvatoral bölgeye doğru yer değiştirdikleri ortaya konmuştır.
Ejakule olmuş spermde, sperm maturasyonu ve kapasitasyonu sırasında sperm lipid ve transmembran proteinlerinin yanısıra çok sayıda yüzeyel proteinlerin de tanımı yapılmıştır. Bu proteinlerden bazıları, örneğin PH 20, tripsin/akrozin inhibitör proteini, galaktoziltransferaz gibi, sperm-zona etkileşiminde önemli rol alırlar.
Sperm yüzey proteinlerindeki bu migrasyon olayı spermin gelişiminin bir parçası olarak ortaya çıkar. IgG ve IgM gibi antikorların kapasite olmuş spermlerde yüzey proteinlerinin migrasyonunu indükledikleri ve sonuçta akrozom reaksiyonuna neden oldukları gösterilmiştir. Hayvan deneylerinde, sperm M42 ve ESA 152 yüzey antijenlerinin normalde postakrozomal bölgede yerleşmiş olmakla birlikte, IgG ile uyarılmaları durumunda anterior bölgeye doğru yer değiştirdikleri gözlenmiştir. Bununla birlikte M42 antijenindeki uyarılma akrozom reaksiyonuna yol açmazken, ESA152’de bu reaksiyon gerçekleşmiştir. Eğer sperm ZP3’e karşı oluşturulmuş IgG ile birlikkte zona pellusida glikopeptidleri ile muamele edilirse, ZP3 reseptörleri arasında bir karşılıklı bağlantı gerçekleşerek akrozom reaksiyonunun gelişmesi indüklenebilr. Bütün bunlar sonuçta akrozom reaksiyonu için tetikleyici mekanizmanın sperm yüzeyindeki ZP3’e karşılık gelen reseptörler arasındaki agregasyon olabileceğine işaret etmektedir. Bu agregasyon deneysel olarak immünglobülinler ile açıklanmış olmakla birlikte fizyolojik şartlarda hangi faktörlerin rol almış olacağı halen araştırılmaktadır.
Yüzey proteinlerinden biri sperm yüzey sülfoglükolipid immobilize edici protein (SLIP1) dir. Sperm-zona etkileşiminde rol alır. Sperm membranı sülfogalaktosilgliserolipid (SGG)’e spesifik bağlanma özelliği vardır. SGG ise spermde bulunan major glikolipiddir. Sperm membranı üzerinde çok sayıda SLIP1 bağlayıcı ligand mevcuttur . Bağlanabilecek SLIP1’den çok daha fazla sayıda SGG reseptörü bulunmaktadır (Sperm başına 1/70.000). Bu nedenle bir bölgede SGG’ye bağlanan SLIP1 daha sonra bazı tetikleyici mekanizmaların etkisiyle başka bölgelerdeki açıkta bulunan SGG’ye doğru yer değiştirir. O halde, SGG’nin SLIP1’in migrasyonunda önemli rolü vardır. Benzer şekilde SGG de sağlam akrozomda apikal akrozomal bölgede bulunurken, spermin kapasitasyonu sırasında ekvatoral bölgeye doğru yer değiştirir. Bu yer değiştirmede esas mekanizma kalsiyumun yol açtığı SGG’nin akıcılığındaki artıştır.
Sperm başının postakrozomal bölgesindeki antijenik yapılar sperm-zona bağlanmasında önemli rol oynar. Sperm-zona bağlanmasında önce postakrozomal (ekvatoral) bölgede bağlanma olur ve arkasından zonadaki oligosakkarid zincirlerinin etkisiyle zonaya bağlı sperm yüzey proteinleri postakrozomal bölgeden sperm başının konveks kenarına doğru göç eder. Spermdeki SLIP1 proteini zona pellusidadaki glikoproteinlere bağlanır.
İnsan spermatozoasında bulunan bir diğer membran proteini ise PH-20 glikozilfosfatidilinozitol (GPI)’dir. Hem plazma membranında hem de iç akrozom membranında bulunur. Bir fonksiyonu hiyolironidaz aktivitesi sayesinde kumulus ooforusun hyalüronik asit komponentinin depolimerizasyonuyla penetrasyonudur. Diğer fonksiyonu ise sperm-zona pellusida etkileşimidir. Yapılan çalışmalar hyaluronidazın akrozomal matriksten kaynaklanan soluble bir enzim olduğunu ortaya koymuştur. Cherr PH-20’nin 64kDa va 53kDa olmak üzere iki ayrı moleküler ağırlık ta formu bulunduğunu göstermiştir. Plazma membranı ve iç akrozomal membranda normalde 64kDa formu bulunurken, akrozom reaksiyonu sırasında bu soluble durumdaki 53 kDa formuna dönüşür ve etkisini bu şekilde gösterir. Ph-20 53kDa ise sadece iç akrozom membranında bulunur ve miktarı 64kDa’dan çok daha azdır. Soluble durumda olan 53kDa PH-20’nin büyük kısmı akrozom reaksiyonu sırasında açığa çıkan proteazlar, glikozidazlar ve fosfolipazlar tarafından PH-20’nin 64kDa formu tarafından yapılır. Major endoproteaz olan akrozin de iç akrozom membranında lokalize halde bulunur. Ming ise normal ve sperm mebranları çıkarılmış spematozoalar ile yaptığı çalışmasında PH-20 proteinini nötral pH’da maksimum hyalüronidaz aktivitesi gösteren plazma membranı kaynaklı PH-20 ve asit pH’da maksimum hyalüronidaz aktivitesi gösteren iç akrozoaml membran kaynaklı PH-20 olmak üzere iki formda incelemiştir.
Spermi çevreleyen kumulusun penetrasyonu için gerekli hyalüronidaz aktivitesi akrozom içeriğinde bulunmaktan ziyade plazma membranından kaynaklanır. Çünkü eğer sperm akrozom reaksiyonunu kumulusun dışında veya hemen içinde tamamladıysa, plazma membranı harap olmuş olacağından kumulus penetrsyonu gerçekleşemez. Çalışmalar, akrozom reasksiyonunu tamamlamış bir spermde hyalüronidaz aktivitesinin ancak %0.5’nin salınabildiğini ortaya koymuştur. Geri kalanı membrana bağlı konumda bulunur. İnsanda hyalüronidaz aktivitesi gösteren tek enzim PH-20’dir. Ancak hyalüronidaz aktivitesi sürekli değildir. Akrozom reaksiyonunu takiben kısa bir süre için perizonal ortam akrozomal içeriğe bağlı olarak asidiktir ve bu nedenle iç akrozomal membran kaynaklı ve asitte aktif 53 kDa-hyalüronidaz fonksiyon görerek zonayı penetre edebilir. Ama hemen arkasından akrozomal içeriğin tükenmesi ile ortam yine nötral pH’ya döner ve hyalüronidazın proteolitik aktiviteside kaybolur. Akrozom reaksiyonunu takiben sperm ZP’ya bağlanır. Bu bağlanma, üzerinde daha önce içinden akrozomal enzimlerin salındığı veziküller bulunan akrozom kılıfı ile ZP arasında gerçekleşir. Daha sonra sperm ZP içine doğru girmeye başlar. Bu sırada iç zona membranı direk ZP içeriği ile temas halindedir. İç akrozomal membranda bulunan PH-20’nin zona penetrasyonu sırasındaki rolü tam bilinmemekle birlikte zonaya bağlanmayı sağlayan bir molekül olarak görev yapıyor olabilir. Bu proteinin endoproteolitik aktiviteye karşı direnci çok yüksektir. Bu nedenle ortamda aktif akrozomal enzimlerin varlığına rağmen zonaya bağlanmayı sürdürebilmektedir. Ayrıca, ZP içinde ve perivitellin aralığında hyalüronik asit bulunmaktadır. Bu PH-20 molekülü hyalüronik asidi eriterek zonadan içeri girmeyi sağlıyor olabilir.
Spermin akrozomal kılıfı üzerinde lokalize bir diğer antijen olan sperm akrozom antijeni-1 (SAA-1) monoklonal antikor tekniği kullanılarak yakın zamanda analiz edilmiştir. SAA-1’in akrozom reaksiyonunda önemi olduğu ortaya konmuştur. İnfertil hastalarda sperm immünfloresan veya RIA ile analiz edildiğinde, SAA-1’in fertillere göre anlamlı derecede düşük bulunmaktadır. Ama SAA-1’deki düşüklük sperm morfolojisi ile bir ilişki göstermemektedir. Bu hastalarda yardımcı üreme tekniklerinin kullanılması gerekmektedir.
Kapasitasyonu takiben spermatozoa ovumun ekstrasellüler matriksi olan zona pellusidaya bağlanır. Arkasından akrozom reaksiyonu ile akrozom kılıfı açılır ve içindeki litik enzimler açığa çıkarak zonanın penetrasyonunu sağlarlar. Spermin zona ile etkileşiminde gerkeli enzimlerin açığa çıkması için akrozom reaksiyonunun olması şarttır. Ama, zonayı çevreleyen kumulusun geçilmesinde ilk etki henüz akrozom reaksiyonu geçirmemiş spermin plazma membranında lokalize PM PH-20 enzimidir. SAA-1 akrozom reaksiyonunda önemli bir enzimdir. Ama reaksiyonu takiben de ekvatoral bölgede tesbit edilebilir. Ortamda SAA-1’e karşı antikor bulunması fertilizasyonu önler. Çalışmalar göstermiştirki, fizyolojik olarak progesteronun veya zona pellusidanın spesifik proteinlerinin uyarması neticesi meydana gelecek akrozom reaksiyonu ortama eklenen spesifik antikorların kalsiyum girişini bloke etmesi nedeniyle engellenmektedir. Bazı erkek infertilitesi olgularında non-genomik progesteron reseptörleri defekti bulunabileceği de gösterilmiştir.
Erkek faktörünün subfertiliteye katkısı %50 olmakla birlikte, subfertil erkekleri teşhis edebilecek analizler henüz yeterli değildir. Konvensiyonel sperm analizi semen kalitesi hakkında genel bir fikir verir. Oysa sperm fonksiyonlarının araştırılması, sperm-zona bağlanması ve akrozom reaksiyonu durumu daha detaylı değerlendirme olanağı sağlayacaktır. Kadına bağlı infertilite tanısı konan bazı olgularda da kocasının sperminde SAA-1 defekti gösterilmiştir. Buda gösteriyorki, rutin semen analizi ile kadın infertilitesi olarak kabul edilen çiftler aslında erkek subfertilitesi grubunda değerlendirilmelidirler. SAA-1 defekti bulunan çiftler günümüz şartlarında yardımcı üreme teknikleriyle tedavi edilmelidirler.
Sperm morfolojisi ile sperm fonksiyonları arasında anlamlı ilişki bulunduğu başka çalışmalarda da gösterilmiştir. Franken zona pellusida ile uyarılmasını takiben akrozom reaksiyonu geçirebilme potansiyelinin %4’ün üzerinde normal morfoloji gösteren spermlerde anlamlı derecede yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Aynı araştırıcı diğer çalışmalarında da sperm-zona bağlanmasında sperm morfolojisinin önemli bir gösterge olduğunğ savunmuştur. Sperm ve zona’nın karşılıklı etkileşiminde ZP3 proteini akrozom reaksiyonunun gelişmesinde primer faktör olarak gösterilmektedir.
İleri derecede teratozoospermisi bulunan bireylerde de fertilizasyonun görülmesi morfolojisi bozuk olmasına rağmen zonaya bağlanma ve akrozom reaksiyonu geçirebilme gibi normal fonksiyonlar gösteren spermatozoaların varlığı ile izah edilebilir. Bu nedenle zona pellusidaya karşı akrozom reaksiyonu gösterebilirliliğinin ölçülmesi fertilizasyonun değerlendirilmesinde faydalı bir yöntem olarak görülmektedir. Akrozom reaksiyonu kalsiyum ionofor gibi uyarıcılar kullanılarak değişik testlerle yapılabilir. Franken solübilize edilmiş zona ile uyarılmış akrozom reaksiyonunun ölçülmesinin daha doğru olacağını ileri sürmüştür (Franken). Spermlerin seminal plazmadan ayrıldıktan hemen sonra akrozom reaksiyonları tayin edilirse spontan akrozom reaksiyon durumları değerlendirilmiş olunur. Bu şekilde akrozom reaksiyonu yüksek bulunursa akrozom instabilitesine bağlı sperm fonksiyon bozukluğu bulunduğunu gösterir. Gerçektende normal sperm morfolojisi oranı ile spontan akrozom reaksiyonu ölçümleri arasında bir ilişki gösterilememiştir. Dolayısıyla bu yöntemle akrozom reaksiyonunun değerlendirilmesinin sperm fonksiyonlarında kullanılmasının doğru olmayacağı ileri sürülmektedir. Son yıllarda insan ZP3 genine ait DNA dizisi ve arkasından hamster ovarial hücrelerinden biyolojik olarak aktif rekombinant ZP3 (rhuZP3) elde edilmiştir. RhuZP3 insan akrozom reaksiyonu için uygun bir agonist olarak ve sperm fonksiyonlarının değerlendirilmesinde ilerisi için ideal bir yöntem olarak gösterilmektedir.
Sadece akrozom reaksiyonu geçirmiş spermlerin iç zona pellusida membranında gösterilmiş olması, akrozom reaksiyonunun başlatılmasında zonanın tek etken olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, zonaya bağlanan her spermin fertilizasyon yapma kapasitesine sahip olacağı düşünülemez. Franken’e göre gerek akrozom reaksiyonu geçirmiş gerekse akrozomu sağlam spermler zonaya bağlanabilir. Bu bağlanma iki basamakta gerçekleşir. I) Gametlerin temas ettikleri ilk 1 dakika içinde gelişen ve gevşek tutunma ile karekterize geçici bağlanma ve II) Gametlerin 2 saatten fazla inkübasyonları sırasında görülen irreverzible kalıcı bağlanmadır ki spermin semi-penetrasyonunu ifade eder. Akrozom reaksiyonu geçirmiş sperm zonanın dış membranına geçici olarak gevşek biçimde tutunur. Oysa akrozomu sağlam sperm dış akrozom membranı vasıtasıyla zonaya irreverzible olarak bağlanır ve zonanın yüzeyindeyken akrozom reaksiyonunu geçirir, arkasından penetrasyonunu yapar. Spermatozoa normalde invitro şartlarda kapasite kazanırken artmış spontan akrozom kaybı göstermemelidir. Aksine, kapasite olmuş sperm önce zona pellusidada ZP3 proteinine bağlanır bundan sonra akrozom reaksiyonu gelişir.
İnsanda sperm-oosit füzyonunda önceden PH-30 antijeni olarak adladırılan fertilin önemli bir diğer sprem yüzey membran proteinidir. Fertilin alfa ve beta subunitlerinden meydana gelmiştir. Beta subuniti NH2 ucunda disintegrine benzer bir zincir taşır. Disintegrinler ise yılan zehiri proteini grubundandır ve integrin ligandları gibi davranarak hücre-matriks etkileşiminde rol alır. Fertilin beta disintegrin benzeri zinciri oosit plazma membranı üzerinde integrinlerle etkileşime girerek spermatozoanın oosit plazma mebranını tanımasını sağlar ve bu şekilde sperm-oosit füzyonunda rol alır. İntegrinlerle etkileşime giren diğer proteinlerde olduğu gibi çoğu disintegrinler de ortak bir bağlayıcı dizi içerirler: RGD; Arg-Gly-Asp. Bu dizideki değişiklikler bağlanma afinitesini ve spesifisitesini etkilerler. RGD dizisi içeren peptidler türe spesisifik etki gösteririler. Yani homolog oositlere sperm bağlanması spesifik disintegrin bağlayıcı reseptörlerle olur. Oositteki integrinlerin RGD dizisini tanımalarınnda vitronektin veya fibronektinin etkili oldukları ileri sürülmüştür.
Gametlerin birbirlerini tanımaları ve ilk bağlanmaları kapasite olmuş spermatozoanın yüzeyinde yerleşmiş karbonhidtat bağlayıcı proteinler (lektinler) ile oositi çevreleyen ekstrasellüler glükoprotein matriks, zona pellusida, arasında olur. Ancak, homolog gametler arasında fertilizasyon sağlamada rol alan moleküllerin tanınmaları üzerinde çalışmalar halen devam etmektedir. Sperm yüzeyinde lokalize olup zona pellusidaya bağlanma aktivitesi gösteren spermadzin proteinlerinden biri AWN-1 olup, tubuli rekti, rete testis ve seminal vezikül epitel hücrelerinden salgılanırlar ve tüm akrozomal kılıf membranını kaplar. AWN-immünpozitif spermatogoniumların direk olarak tubuli seminiferilerin bazal membranı üzerinde ve komşu hücreler içinde lokalize olmaları bu proteinin hücre maturasyonu ile ilgili olabileceğini düşündürmüştür. Eksperimental çalışmalarda bir diğer spermadezyon proteini olarak da SSP-7 tanımlanmıştır. Epididim ve özellikle duktus deferens ampullasından salgılanan SSP-7, rete testis epitel hücreleri içinde bulunamamıştır. Boğalarda tesbit edilen AWN spermadesini ile aygırlarda bulunan SSP-7 spermadezinlerinin aminoasit dizileri büyük oranda homoloji göstermektedirler (Reinert). Ancak, AWN ve SSP-7 moleküllerinin sekresyon yerleri her iki türde farklılık göstermektedir. İndirek immünfloresan çalışmalarında SSP-7 aygır spermatozoasında ekvatoral bölgeye sınırlı kalırken, boğada AWN tüm akrozomal membranı kaplamaktadır. Bütün bu bulgular, türe özgü fertilizasyonda farklı orijin ve lokalizasyonlara sahip, morfolojiyi oluşturan yapısal spermadezin proteinlerinin rol aldıklarını vurgulamaktadır.
Sperm maturasyonunun en önemli göstergesi epididmal kanal boyunca geçerken görülen plazma membran modifikasyonudur. Epididim epitelinden sekrete edilen bazı moleküller sperm yüzeyince absorbe edilirlerken, aynı zamanda hem membran yapısında bulunan hem de yüzeyden absorbe edilmiş proteinlerin lokalizasyonları da değişir yada kendileri değişir veya maskelenirler. Bütün bu değişiklikler spermin fertilizasyon kapasitsinin bir göstergesidir.
Monoklonal antikorların spermatozoaya bağlanmaları flowsitometri ile değerlendirilebilir. Bu şekilde TÜS-2, TÜS-10 ve TÜS-17 sperm kuyruğuna, TÜS-1 akrozomal içerikle, TÜS-19 ve TÜS-20 akrozomal membranla bağlanarak kantitatif inceleme için kullanılabilirler. Bu antikorların bağlandığı antijenlerin fonksiyonel önemleri tam bilinmemekle birlikte, genel olarak spermatozoanın fonksiyonu konusunda bir fikir edinilebilir. Bütün bu antijenlerin bulunması spermatogenezin sağlamlığı ve normal spermatogenez durumunda ise daha kaliteli spermatozoa yapıldığına işaret eder. İnfertilite ile azalmış pididimal antijenler arasında bir ilişki bulunduğu ortaya konmuştur.
Anormal morfolojili spermlerde DNA hasarı daha yüksek oranda bulunmaktadır. ICSI yapılan olgularda DNA hasarı yüzdesi ile fertilizasyon oranları arasında negatif ilişki gösterilmiştir. Spermiyogramlarında morfoloji ve motilite bozukluğu gösteren olgularda ICSI yapılırken normal görünümlü spermatozoa kullanılsa da, bu hücrelerde DNA hasarı bulunma olasılığı oldukça yüksek olmaktadır. Spermatozoada kromatin anomlailerinin dekondensasyonun başlama yada tamamlanmasında engel olması mümkündür. Bütün bu bulgular değerlendirildiğinde görülmektedirki sperm membran yapısı fertilizasyonun gelişmesinde önemli bir role sahiptir. Gerek gametlerin füzyonu gerekse spermatozoanın genetik materyalindeki defektler ile birlikteliği invivo veya invitro fertilizasyon bozuklukları olgularında sperm morfolojisinin özellikle tetkik edilmesi, hatta bu yapıyı kullanan fonksiyon testlerinin kullanılması gerekliliğini vurgular niteliktedir.
Spermin ovum içine girmesi birbirini takip eden bir seri reaksiyonu ile gerçekleşir. Sperm-yumurta füzyonundan primer sorumlu adezyon proteinleri integrin ve disintegrinlerdir. Bir adezyon proteini olan PH-30 ise akrozom üzerinde, postekvatoral bölgede ve plazma membranında lokalizedir. Spermin zonaya ve oolemmaya bağlanmasında görevli bir füzyon proteinidir. PH-30 round spermatidlerden sentezlenir. İntegrin ovum membranları üzerinde, disintegrin ise sperm membranı üzerinde bulunur. Gerek PH-30 gerekse disintegrinler sperm üzerinde glikozilasyon bölgeleri içerirler ve bu şekilde ovum üzerindeki bağlayıcı proteinlerle bağlanabilirler. PH-30 alfa ve beta disintegrin molekülleri posterior sperm başında yerleşmişlerdir. Alfa disintegrini oolemmanın penetrasyonunda da rol alır. Beta subüniti ise ovum üzerinde bulunan integrine Arg-Gly-Asp (RGD) aminoasit dizisi vasıtasıyla bağlanırlar. RGD adezyon peptidi spermatozoa üzerinde bulunur ve füzyondan sorumlu primer bağlanma bölgesini oluşturur. Bu peptid dizisinde değişiklik olması sperm-ovum füzyonunu bozar. Türe spesifik füzyon bu şekilde korunabilmektedir. İntegrin oosit membranları üzerinde bulunur. İntegrinin aktivasyonu ve fertilizasyon için Ca gereklidir. İntegrin bağlayan peptidlerin kulanılması veya alfa ve beta peptidlerin monoklonal antikorlarla presipitasyona uğramaları fertilizasyonu engeller.
Zonayı geçip perivitellin aralığa giren spermatozoa oolemmaya (vitellin membran) bağlandıktan sonra, membran yapısında bulunan peptidlerin etkisiyle oolemmadaki K kanallarını aktive eder. Bu şekilde ovum membranında depolarizasyon meydana gelmiş olur. Membranın bu şekilde depolarizasyonu bir elektrik sinyali doğurur. Bu elektrik sinyali vasıtasıyla ikinci polar cisim oluşarak dışarı atılır. Eksperimental çalışmalar bu sırada ortamda belirli konsantrasyonda CaCl bulunmasının gerektiğini ortaya koymuştur. Eğer elektrik sinyalinin şiddetinde bir değişiklik olursa ovumda aktivasyon meydana gelmez. Ovumun aktivasyonu için gerekli diğer koşullar arasında ortam ısısı, pH, Ca ve antisperm antikorların bulunmaması önemli faktörlerdir.
Spermatozoaya karşı oluşan antikorlar ile oosit membranı arasındaki ilişki de immün bir reaksiyon ile gametlerin birbirlerine yaklaşmalarını sağlayarak füzyonlarını stimüle edebilir. Antikorların gamet membranlarından Na/K iyon geçişine yol açarak transmembran uyarı sinyallerinin oluşmasını sağladıkları gösterilmiştir.
Spermatozoanın oolemma üzerinde spesifik reseptörlere bağlanması G-proteinlerini ve inositylphosphatase’yi aktive ederek membran fosfolipidlerinin oluşmasını sağlar. Gametlerin füzyonu neticesi ovumun yüzeyinde oluşan mikrovilluslar spermatozoayı ovumun içine çekerler. Bu işlemler integrinler veya hücre strüktürü tarafından yönetilir. Oositlerin aktivasyonu için gametlerin füzyonunun şart olup olmadığı tartışmalıdır. Çünkü, ooplazma içine spermin direk enjeksiyonu bile oosit için yeterli bir stimulus oluştuabilir.
Oosit membranının K’a bağlı depolarizasyonunu takiben oosit içindeki depolardan Ca salınımı olur. Fertilizasyonu takiben ovumun aktivasyonunda Ca esas role sahiptir. Neticede Ca’a bağlı bazı olaylar gelişir: Metafaz 2 aktive olur, kortikal granüller açığa çıkar, ikinci polar cisim atılır. Spermin inseminasyonunu takiben Ca’un açığa çıkması ve fertilizasyon için gerekli uyarıların başlaması 20-35dk içinde olur.
Spermatozoanın oosit membranındaki spesifik reseptörlere bağlanmasıyla oosit içine veya çevresine yayılan bir takım sinyaller açığa çıkar, hücre içine Ca girişi artar ve phosphoinositide yolu aktive olur. Membran aktivasyonu ve hücre içi Ca artışında G-protein, InsP3 ve PIP2, DAG (diacylglycerol), PK-C yolu işleyerek gerçekleşir.
Bir diğer görüş ise spermatozoanın yumurta içine bir stoplazmik faktör taşıması ve bu şekilde yumurtanın aktive olmasıdır. Spermin sitozolünden ekstrakte edilen bir proteinin membran hiperpolarizasyonunu ve hücre içi K artışını stimüle ettiği ortaya konmuştur.
Sperme ait proteinazlar da oositleri aktive edebilir. Somatik hücrelere integrinlerin bağlanmasını takiben Ca çıkışının arttığı gösterilmiştir. Spermin oolemmaya bağlanması ile açılan kanallardan spermdeki aktive edici faktörün ooplazmaya geçişi olur. Burada kalsiyumun kendisi, InsP3 veya sperme ait bir sitozolik protein sorumlu olabilir. Membranın hiperpolarizasyonu potasyumun dışarı doğru çıkışını uyarır. Oosit aktivasyonunda aracı faktörler sperm faktörü, inozitoltrifosfatlar ve fosfolipaz olabilir. InsP3’ün ilgili reseptöre bağlanması ile hücre içi kaynaklardan Ca salınımı olur. Ca’un açığa çıkması ile yumurta içindeki maturasyon uyarıcı faktörler de aktive olur. Bu şekilde hücre siklusu ve DNA sentezi başlatılır. InsP3’ün pronuklear membranı da parçalayabildiği öne sürülmüştür. Bu reaksiyonlarda aracı maddeler cADPriboz veya cGMP olabilir.
Spermin oolemmaya bağlanması: Zona pellusidayı geçen spermatozoa corona hücreleri ve oval şekillerinin yönlendirmesi ile perivetellin aralığa girerek oolemma ile temas eder. Burada ilk temas postakrozomal bölgede ekvotoral bölge yakınında bulunur. Burada membran fosfolipidleri değişikliğe uğrar. Spermatozoa plazma membranının oosit plazma membranı ile birleşmesi neticesi spermatozoa immıtil hale gelir. Spermatozoa oolemma üzerindeki mikrovilluslarla füzyona uğrar. Ooplazma içine sperm başının girmesi ve pronukleus migrasyonu mikrofibrillerin ve kalsiyum çıkışı ile tetiklenir. Füzyon ile birlikte mikrofibriller aktin-miyozin sistemi ile retrakte olarak spermi pasif olarak ooplazma içine çeker.
Spermin bağlanmasında olemma üzerinde spesifik bölgeler sorumludur. Genellikle polar cismin karşı kutbu tercih edilir. Ekvatoral segmentte bulunan fibronektin ve integrinlerin oolemmaya spermatozoanın bağlanmasındaki rolleri araştırılmaktadır.
Spermatozoanın ZP’ya bağlanması: Spermatozoa zonaya önce gevşek bağlanır, sonra kuvvetli tutunur. Kapasite olmuş spermatozoanın yüzeyinde bulunan reseptörlerin yapısındaki sakkaridler fükoz, galaktoz ve asetile olmuş aminoşekerlerdir. D-Mannoz da vardır. Sakkaridler ZP3 ve diğer zona reseptörlerine bağlanırlar. Bu bağlanma spermatozoanın genetik kontrolü altındadır.
Akrozom reaksiyonu sırasında spermatozoaya bağlı hydrolase ve galaktosyltransferase enzimleri açığa çıkarak zonaya bağlanırlar. PH-30 sperm-zona bağlanmasında rol alan bir adezyon proteinidir. Spermin kapasitasyonu sırasında akrozin sperm başının ön yüzüne taşınır. Akrozinin sperm-zona bağlanmasında önemli bir rolü olduğu gösterilmiştir. Akrozonon sperm başının ön bölgesine doğru migrasyonu akrozom reaksiyonunun başlatılmasında tetikleyici bir mekanizmadır. Akrozom ve plazma membranlarınını füzyonu ile bol miktarda dışarı salınırlar. Akrozin prekürsörü olan proakrozin karbonhidratlara bağlanarak akrozom reaksiyonuna uğramış spermatozoa ile zona arasında karşılıklı bir bağlanma sağlamış olur. Bu şekilde proakrozinin zona penetrasyonunda zonaya daha sıkı yaklaşması sağlanmış olunur.
Zona pellusida üzerindeki primer sperm reseptörü ZP3’dür. Her bir spermatozoa çok sayıdaki bu reseptörlere bağlanır. Bu tutunma sperm plazma membranının agregasyonuna yani bir şekilde yamanmasına neden olur. ZP3’bağlanması türe özgü bir bağlanmadır. Akrozom reaksiyonna uğramış spermatozoalar zonanın penetrasyonu süresince zonaya bağlı halde beklerler ve tamamlandığında serbest kalırlar. Bu sıradaki bağlanma ise iç akrozom membranı ve bir ikinzil reseptör olan ZP2 arasında gerçekleşir. Daha zayıf olan bu ikincil bağlanmalar spermatozoanın zonayı penetrasyonu sırasında işlemş kolaylaştırmaya yardımcı olur.
Fertilizasyon sırasında spermin sentrozomu oositiniçine girer. Bu sentrozoma oositin mikrotubili organize edici merkezi (MTOC) adı verilir. Bunun dışında mikrotubuli formasyonuna sadece oosit içind arest olmuş metafaz plağında rastlanılır. Oosite ait sentrozom ise mayozda kromozomların üzerinde dizildiği metafaz plağındaki polar görevini tamamladıktan sonra tekrar kendini yenilemez. Sentrozomun yapısnı oluşturan 3 adet protein vardır: 1) dişiden gelip spermatozoa sentrozomunun yapısına giren ve mikrotubuli oluşumunda önemi bulunan gama-tubulin, 2) kalsiyum bağlayan centrin, 3) NuMA mitoz plağını lokalize eden nükleer protein ve 4) sentrozomun organizasyonundan sorumlu pericentrin.
Spermin sentrozomunun girişi ile aynı zamanda oositde aktive olarak ikinci polar cismini atar ve pronukleus oluşumunu sürdürür. İnseminasyonun 6. saati içinde sperm sentrozomundan çıkan mirotubuli uzantıları dişi pronukleusu ile temas edinceye kadar bütün sitoplazmayı tarar ve oositin pronukleusunu tutarak erkek pronukleusunun yakınına çeker. Pronukleusların bu yer değiştirmeleri dynein ve kinesin motor proteinleri sayesinde olur. Her iki pronukleus sitoplazma içinde ekzentrik lokalizasyonda bulunurlar. Mitozun profaz döneminde erkek ve dişi kromozomlar kondanse olurlar ve bu sırada duplike olarak iki kutba doğru hareket eden sentrozomların arasındaki mitoz iğciklerinin üzerinde karşılıklı olarak dizilirler. Demekki insanda sentrozom geçişi erkeğe ait bir fonksiyondur.
Sentrozoma ait yapısal yada fonksiyonel bozuklukların fertilizasyonu olumsuz etkiledikleri gösterilmiştir. Bu şekilde ortaya çıkan bozuklukları Hewitson 3 grupta inceler: 1) spermin mikrotubuli oluşturmasındaki bozukluk, 2) sperm sentrozumunun baş’dan kopması ve 3) mikrotubulilerin oluştukatn sonra uzayamamaları. Bunların dışında spermin oosit içine girememesi, mayz metafazının yeniden aktive olamaması, çok sayıda dişi karyomerlerinin oluşması ve erkekte kromozomları erken kodense olarak mayo plağını oşturması da yine sentrozom ile ilgili diğer bozukulklardır. Sentrozomdaki bu bozukluklar ICSI ve diğer yardımcı üreme teknklerinde karşılaşılan ve etyolojisi ortaya konamayan diğer fertilizasyon yetmezliklerinin muhtemel nedenlerini izah edebilir niteliktedir. Bu olgularda kromatin dekondensasyonu asenkronoz olmaktadır. Akrozom kılıfının altındaki kromozomlar başın posteriorunda yerleşmiş olanlara göre daha yavaş dekondanse olurlar. Asenkronoz dekondensasyonun önemi tam anlamıylaortaya konmamış olmakla birlikte akrozomun altında bukunan bölgeye nukleus proteilerinin naklinde ciddi bozulmalar görüleblmektedir. Ayrıca bunlarda genetik defektlerin de gelişebileceği bildirilmiştir. Erkeğe bağlı infertilite olgularında sperm sentrozomuna ait bozuklukların gerek normal gerekse yardımcı üreme teknikleriyle elde edilebilecek fertilizasyondaki başarısız kalnmasındaki önemleri son yıllarda üzerinde çalışılan bir konu olma özelliğindedir.
Prof.Dr. Kaan AYDOS
