Kaan AYDOS
Azoospermiye erkek infertilitesi olguları arasında %10 oranında rastlanılmaktadır. Bunların büyük kısmında etyoloji testiküler yetmezliğe bağlıyken, %20’sinde bilateral obstrüksiyon sorumludur. Genel olarak değerlendirildiğinde ise infertilitede seminal kanallara ait obstrüksiyon sıklığı %7 civarındadır (35). Geçirilmiş skrotal veya inguinal operasyon ya da tekrarlayan genital enfeksiyon hikayesi bir obstrüksiyonun varlığını düşündürmelidir. Bu hastalarda testis volümü normal olup, FSH ve LH hormon düzeyleri de yine normal sınırlarda bulunur.
İnfertil erkek populasyonunun %1-2’sinde konjenital bilateral vaz deferens agenezi (CAVD) söz konusudur. İnfertilite nedeniyle tetkik edilen erkeklerin yaklaşık %20’sinde ultrasonografik veya vazovezikülografik incelemeler ile ejakulatör kanallara ait fonsiyonel ya da mekanik obstrüksiyon yapması muhtemel bir anomali saptanırken, bunların %4’ünde ejakülatör kanallarda parsiyel bir obstrüksiyonun varlığı söz konusudur (36). Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarında ejakulatın tamamını veya büyük kısmını prostat sekresyonu oluşturur. Ejakulat volümü 0.5-1 ml, pH ise 5.5-6.5 civarındadır. Koagulasyon oluşmayıp, semende früktoz negatiftir. Bu nedenle, vaz deferenslerin palpe edildiği ama seminal volümün azaldığı ve asitleştiği azoospermi olgularında komplet bilateral ejakulatör kanal darlığından şüphelenilmelidir. Parsiyel tıkanıklıkların kliniği ise değişkendir. Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarının tedavisinde transrektal ya da transperineal kist aspirasyonu, transuretral endoskopik rezeksiyon veya seminal kanalların yıkanması kullanılan metodlardır.
Seminal parametreleri ileri derecede bozuk olan erkeklerin %20-25’inde ise epididimal oligozoospermi bulunmaktadır (37). Bu durum, epididim içinde skar dokusu oluşumuna neden olan klinik ya da subklinik geçirilmiş enfeksiyonlara bağlanmaktadır. Skar dokusu epididimal tubulülere bası yapmakta ama bir miktar sperm çıkışına da izin vermektedir. Son yıllarda seksüel geçiş gösteren hastalıkların artması ile bu oranın daha da yükselmesi beklenmektedir. Geniş serili çalışmalarda, sperm konsantrasyonunun 5 milyon/ml’den düşük, %20’den az motilite ve %25’in altında normal formda sperm bulunan olguların %49’unda testis biyopsilerinde normal spermatogenez saptanırken epididimal bir patoloji de eşlik etmektedir. Spermatogenezin ve epididimlerin her ikisinin de normal olduğu olgular sadece %4 oranındadır. Geri kalanlarında ise spermatogenezde bir bozukluk söz konusudur. Epididimal oligozoospermi olgularının tedavisi mikrocerrahi olup, epididimolizis ya da vazoepididimal anastomozlar uygulanabilir. Sonuçları oldukça başarılıdır. Değişik etyolojilere bağlı gelişebilen vazal ya da epididimal obstrüksiyonların mikrocerrahi ile tedavileri neticesi %38-96’sında anastomoz açıklığı ve %19-82 arasındada spontan gebelik oranları bildirilmektedir (38). Sonuçlardaki değişkenlik obstrüksiyonun seviyesi ve süresi, epididim fonksiyonları, tekrarlayan genital enfeksiyonların varlığı ve antisperm antikor gelişimine bağlanabilir.
Obstrüktif azoospermi olgularında yukarıda bahsedilen tedavileri takiben bir düzelme sağlanamamışsa üremeye yardımcı teknikler kullanılmalıdır. Ejakulattan yeterli sayı veya kalitede sperm elde edilemediği olgularda testisden ya da epididimden alınan spermler ICSI işleminde kullanılarak olguların sırasıyla % 33.3 ve %44.3’ünde gebelik sağlanılabilir (39).
Nonobstrüktif azoospermi‘ye ise değişik faktörler yol açabilir: maturasyon arresti, germinal aplazi (Sertoli cell only sendromu), kriptorşidizm, 
kemoterapi veya Klinefelter sendromu bunlar arasında sayılabilir. Testiküler yetmezlikli bu olguların yaklaşık %50’sinda testislerden spermatozoa ekstrakte edilebilmektedir (40). Geri kalanlarında ise yuvarlak spermatid nukleusu (ROSNI) veya değişik evrelerde spermatidler kullanılarak ICSI yapılabilmektedir (41). ICSI’de kullanılabilecek en ideal spermatid evresi uzamış (elongated) ve matür spermatidlerdir (42). Bununla birlikte, uzamakta olan (elongating) ya da yuvarlak spermatidler kullanılarak da fertilizasyonun başarılması mümkündür.
Hoffman veya Nomarski optikleri kullanılarak bile haploid yuvarlak spermatidleri diploid spermatositlerden, spermatogoniumlardan, lökositlerden, eritrositlerden ya da Sertoli hücre nukleusundan ayırt etmek her zaman kolay olmamaktadır. Bu amaçla bazı kriterler getirilmiştir (43). Yuvarlak spermatidlerin daha küçük olmaları (6.5-8 ) ve çıkıntı yapmış akrozom veziküllerinin görülmesi, belirgin nukleusları ile bunu çevreleyen sitoplazma zonu bunların spermatogoniumlardan, spermatositlerden ya da lenfositlerden ayırt edilmesinde yardımcı bazı kriterlerdir. Bununla birlikte, ikinci mayoz bölünmesini yeni tamamlamış bir spermatidde henüz akrozom yapısı gelişmediği için, Golgi fazı spermatidleri özellikle küçük lenfositlerle karışabilmektedir. Belirgin nukleolusu ve transparan, düz sınırlı görünümleri ile Sertoli hücre nukleuslarını görebiliriz. Bütün bu kriterlere rağmen bir yuvarlak spermatidin canlı olup olmadığına ya da genomik yapısının normal olup olmadığına, hücreyi boyamadan veya parçalamadan karar vermek imkansızdır. Tek kriter mikropipet içine aspire edildikten sonra spermatidin lizis olmadan canlılığını sürdürdüğünün gözlenmesidir. Komplet spermatogenez bozukluğu gösteren testislerin sadece %10’unda yuvarlak spermatid bulunabilmektedir. Daha önceki tahlillerinde azda olsa spermatozoa görülmüş olan olgulardan elde edilen spermatidler kullanılarak yapılan ICSI işleminden elde edilen başarı, şiddetli spermatogenez defekti bulunan olgulardakine göre çok daha düşüktür. Yuvarlak spermatid kullanılacak olgularda işlemin etkinliğinin ve Y kromozom delesyonlarının genetik geçiş risklerinin mutlaka önceden çiftlere izah edilmesi gerekmektedir.
TESE işlemi sırasında spermatid bulunduktan sonra başka hücre aranmasına son vererek bu spermatidin kullanılması ya da araştırmaya spermatozoa bulununcaya kadar devam edilmesi konusu halen tartışılmaktadır. Spermatid bulunan olgularda mutlaka spermatozoada bulunabileceğini savunan araştırmacıların yanı sıra, spermiyogenez arresti olgularında Sertoli hücreleri ile bağlantılarının kesilmesi neticesi daha ileri maturasyon gösteremeyen spermatidlerin spermatozoa olmasa da elde edilebileceğini savunan bilim adamları da bulunmaktadır (44, 45). Çalışmalar, testis dokusunun fazla travmatize edilmesinin ileride atrofi yapabileceğini ve başka uygulamalarda kullanılamaz hale getirebileceğini ortaya koymuştur (46). Bu nedenle hastanın durumu, önceki biyopsileri ve kadın faktörü de göz önüne alınarak bu işlemin sınırına karar verilmesi daha uygun olacaktır.
TESE işlemi sırasında mutlaka skrotal eksplorasyon da yapılmalıdır. Bu sırada vazal ya da epididimal bir obstrüksiyonun varlığı teşhis edilebilirse, mikrocerrahi olarak obstrüksiyon giderilmeli ve uygun anastomoz teknikleri kullanılarak sperm kanallarının bütünlüğü sağlanılmalıdır. Eğer epididimal mikroaspirasyonla sperm elde edilebilecekse, öncelikle bu yapılmalı, yeterli kalite ve kantitede sperm elde edilemiyorsa testislerden doku çıkarılmalıdır. Daha distal obstrüksiyonlarda vaz deferensten aspire edilen sperm de kullanılabilir. Daha önce yapılmamış ise bu olgularda aynı seansta testis biyopsisi de alınmalıdır.
İnfertilite olgularında tanısal amaçlı testis biyopsisi artık uygulanmamaktadır. Proksimal seviyede bir obstrüksiyon ya da nonobstrüktif nedenli azoospermi bulunan erkeklerde skrotal eksplıorasyon yapılmalı, aynı zamanda hem epididimlerin durumu ve vazın açıklığı kontrol edilmeli, hem de MESA veya TESE ile spermatozoa araştırılmalı, bulunursa ileride ICSI’de kullanılmak üzere dondurularak saklanılmalıdır. Gerekirse rekonstrüktif mikrocerrahiye geçilmelidir. Bu sırada testis biyopsisi de alınmalı ve infertilite ile eş zamanlı bulunabilecek başka patolojilerin varlığı, azoosperminin derecesi ve infertilite nedeni olabilecek patolojiler araştırılmalıdır. Buradan da anlaşılacağı üzere, TESE veya testis biyopsisi sadece doku çıkarmak değil, beraberinde ek girişimleri de gerektirebilecek önemli bir uygulamadır. Bunun eğitimini almış uzmanlar, androloglar, tarafından yapılması uygun olur. Diğer yandan, sonuçta ortaya çıkabilecek komplikasyon veya yan etkilerin de tedavisi sorumluluk gerektirir.
TESE işlemi operasyon mikroskopu altında yapılmalıdır (Mikrocerrahi-TESE). Testisin damarlanmasının en az olduğu bölgesi alt kutup iç, dış ve ön yüzü ile üst kutup iç ve dış bölgeleridir. Mikroskop ile damarlanmanın olmadığı alanlardan ince (tercihan göz ameliyatlarında kullanılan) bir bistüri ile kesi yapılması uygun olur. Testis dokusu arasında da yine damarsız hatlardan diseksiyon yapılarak ilerlenilmelidir. TESE işleminde seminifer tubülülerin mikrodiseksiyonla eksize edilmeleri en ideal olan yaklaşımdır. Fibrotik ve kollabe, ince tubülü alanlarının yanında, dolgun ve daha parlak olan tubüllerin seçilerek eksize edilmesi, hem daha az volümde doku çıkarılmasına hem de germinal hücre bulma şansının daha fazla olmasına olanak verecektir. Mümkün olduğu kadar kanatmaksızın kesilen testis tubuli dokuları uygun kültür ortamı içine alınarak bekletilir. Testisin üst ve alt kutuplarından bilateral olarak biyopsilerin alınmasının yeterli olacağı çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Ya da, her seferinde spermatozoa aranarak bulununcaya kadar işleme devam edilebilir. İşlem sonunda tunika ince absorbe olur bir sütür ile kapatılır. Hemostaz bipolar koter ile sağlanmalıdır.
Biyopsi esnasında testisin, epididimin ve vaz deferensin muyene edilmesi çok önemlidir. Bu sırada gerekirse mikrocerrahi işlemine ihtiyaç duyulabilir. İşlemin uzun sürmesi olasılığını da düşünerek genel anestezi kullanılması uygun olur.
Testislerden sperm elde etmede perkütan iğne aspirasyonu veya biyopsisi de önerilen diğer bir metoddur (47). Özellikle obstrüktif olduğuna daha önce karar verilmiş olgularda tercih edilmelidir. Sperm eldesi konusunda değişik çalışmalarda farklı sonuçlar bildirilmektedir. Ancak, eksplorasyon ile beraber testislerden açık cerrahi teknik ile TESE yapılması daha faydalı ve başarılı bir yöntemdir. Perkütan girişimlerin ancak testis biyopsisi alınmasında uygulanması doğru olur.
Sonuç olarak, azoospermi olgularında TESE ile elde edilen hücrelerin ICSI’de kullanılması, infertilite tedavisinde son derece önemli bir gelişme olmuştur. Daha erken evre germinal hücrelerin kullanılması ile fertilizasyon ve gebelik elde edilmesi gelecekte bu grup hastaların da tedavilerini mümkün kılacaktır. Ancak, yukarıda sayılan nedenlerden dolayı gerek başarının arttırılması gerekse bir komplikasyonla karşılaşmamak için, uygulamaların sadece konunun uzmanı yetkili hekimler tarafından gerçekleştirilmesi son derece önemlidir.
TESE ile Alınan Materyalin Hazırlanması ve ICSI’de Uygun Hücrenin Seçimi:
Spermi yakından tanıyan androloji uzmanının bir diğer görevi ise TESE için çıkarılan testis dokusu içerisinde en uygun hücrenin elde edilmesinin
teminidir. Testis dokusu yukarıda tanımlanan işlemlerle alındıktan sonra önce mekanik yolla parçalanır. Bu işlemin enzimatik digesyon metodu ile yapılması da tavsiye edilmektedir (48). Bizim gözlemlerimiz, mekanik ayrıştırma ile yeterli hücre elde edilemeyen olgularda enzimatik ayrıştırmanın kullanılması yönündedir. Böylece enzimlere (DNAse ve collagenase tip IV) ait muhtemel toksik etkilerden, her ne kadar spermlerin canlılığında bir bozulma yapmadıkları gösterilmişse de, korunulmuş olunur. Bu yöntemlerle eğer spermatozoa görülmüşse bunların ICSI işlemi için hazırlanmaları gerekir. Swim-up uygulanacaksa, testis dokusu ekstresi vortekslendikten sonra 5-10 dk süreyle çökmeye bırakılır. Takiben üstteki sıvı kısmı alınarak bilinen yıkama işlemine, arkasındanda swim- up’a geçilir. Sperm sayısının çok düşük olduğu olgularda direk pellet kullanılabilir. TESE olgularında değişik solüsyonlarla hazırlanmış gradient sistemleri de kullanılabilir. Bu şekilde doku artıkları, eritrositler ve lökositler büyük oranda ortamdan uzaklaştırılmış olunur. Gradient sistemleri kullanılacaksa, bunların miktarları ve santrifüj süreleri sperm sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır (49). Bu teknikte önce lökositler ortamdan uzaklaştırıldığı için, santrifüj sırasında bunlardan ortama çıkabilecek serbest oksijen radikallerinin önceden uzaklaştırılması da mümkün olmaktadır.
TESE işlemi sırasında eritrositlerin ortamdan uzaklaştırılacağı eritrosit eritici mediumları (ELB) kullanılabilir (50). Özellikle biyopsilerin aşırı kanamalı ortamda alındığı olgularda eritrosit eritici solüsyonları faydalı olabilir.
Testis dokusundan sperm elde edildikten sonra bunlar hemen ICSI işleminde kullanılabilecekleri gibi 24-72 saat süreyle kültür ortamında inkübe edilerek bekletilebilirlerde. Bu şekilde, immotil spermatozoaların maturasyonlarını tamamlayarak motil hale geçmeleri ya da yuvarlak spermatidlerin uzayan-uzamış- matür spermatid evrelerine gelmeleri mümkündür (48). Bekleme işlemi inkübatör içinde 37C’de yapılabileceği gibi 30C’de yada oda ısısında da olabilir. Oda ısısında sperm enerji tüketiminin minimal olacağı, bu nedenle daha uzun süreli saklamaların sağlanabileceği ileri sürülmektedir (51). 10 günlük saklamalarda bile motilitenin %20 oranında korunabileceği bildirilmektedir (52).Bu konuda daha geniş serilerin sonuçlarının yol göstereceği kanısındayız.
Testis dokusu alındıktan sonra bir kısmı dondurularak ileri uygulamalar için saklanabilir (53). Ayrıca, TESE yapıldıktan sonra elde edilen spermatozoalar da dondurularak saklanılabilir (39). Testis dokusu veya sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonunun her TESE olgusunda uygulanmasının gerekli olduğu kanısındayız. Bu şekilde, daha sonra yapılacak ICSI olguları için hazır hücre saklanmış olunur. İlk TESE işleminden sonra testiste damarlanmanın bozularak ya da hematom gelişimine bağlı olarak atrofi gelişmesi ve ikinci uygulamalarda hücre bulunmasını güçleştirmesi mümkündür. Testisten elde edilen spermatozoaların kriyoprezervasyonunda canlılık oranı ortalama %30 olarak bildirilmektedir. Dondurulmuş-çözünmüş epididimal spermler kullanılarak yapılan ICSI olgularında gebelik oranları bir çalışmada %33.8 olarak bildirilmiştir (39).
KAYNAKLAR
1. Mosher WD, Pratt WF: Fecundity and infertility in the United Sates: incidence and trends. Fertil Steril, 56: 192-193, 1991.
2. Yamamoto M, Hibi H, Tsuji Y, Mhyake K: The effect of varicocele ligation on oocyte fertilization and pregnancy after failure of fertilization in in vitro fertilization-embryo transfer. Hinyokika Kiyo, 40; 683-687, 1994.
3. Dubin L, Amelar RD: Varicocelectomy: 986 cases in a twelve-year study. Urology, 10; 446-449, 1977.
4. Schlegel PN: Is assisted reproduction the optimal treatment for varicocele- associated infertility? A cost-effectiveness analysis. Urology, 49; 83-90, 1997.
5. Schlegel PN, Goldstein M: Microsurgical vasoepididymostomy: refinements and results. J Urol, 150: 1165-1170, 1993.
6. Torok L: Treatment of oligozoospermia with tamoxifen (open and controlled studies). Andrologia, 17: 497-500, 1985.
7. O’Donovan P, Vandekerckhove P, Lilford L, et al: Treatment of male infertility: is it effective? Review and meta-analyses of published randomized controlled trials. Hum Reprod, 8: 1209-1214, 1993.
8. Suleiman SA, Ali ME, Zaki ZM, el Malik EM, Nasr MA: Lipid peroxidation and human sperm motility: protective role of vitamin E. J Androl, 17: 530-537, 1996.
9. Jarow JP: Life-threatening conditions associated with male infertility. Urol Clin North Am, 21: 409-415, 1994.
10. World Health Organization: WHO semen manual for the examination of human semen and cervical mucus. Cambridge, Cambridge University Press, 1997.
11. Eggert-Kruse W, Bellmann A, Rohr g, tilgen W, Runnebaum B: Differentiation of round cells in semen by means of monoclonal antibodies and relationship with male infertility. Fertil Steril, 58: 1046-1050, 1992.
12. Wolff : Methods for the detection of male genital tracy inflammation. Andrologia, 30 (Suppl 1): 35-39, 1998.
13. Wolff H: The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril, 63: 114-119, 1995.
14. Wolf H, Poltich JA, Martinez A, et al: Leukocytospermia is associated with poor semen quality. Fertil Steril, 53: 528-534, 1990.
15. Turek PJ, Lipshultz LI: Immunologic infertility. Urol Clin North Am, 21: 447-469, 1994.
16. Hill JA, Haimovici F, Politch JA, et al: Effects of soluble products of activated lymphocytes and macrophages (lymphokines and monokines) on human sperm motion parameters. Fertil Steril, 47: 460-465, 1987.
17. Bar-Chama N, Goluboff E, Fisch H: Infection and pyospermia in male infertility: is it really a problem? Urol Clin North Am, 21: 469-475, 1994.
18. Eggert-Kruse W, Pohl S, Naher H, et al: Microbial colonization and sperm- mucus interaction results in 1000 infertile couples. Hum Reprod, 7: 612-620, 1992.
19. Gnarpe H, Friberg J: Mycoplasma and humanreproductive failure. I. The occurrence of different mycoplasmas in couples with reproductive failure. Am J Obstet Gynecol, 114: 727-731, 1972.
20. Busolo F, Zanchetta R: The effect of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum on hamster egg in vitro penetration by human spermatozoa. Fertil Steril, 43: 110-114, 1985.
21. Toth A, Leser ML, Brooks C, et al: Subsequent pregnancies among 161 couples treated for T-mycoplasma genital tract infection. N Eng J Med, 308: 505-507, 1983.
22. Hollanders JMG, Carver-Ward JA: Male infertility from A to Z. Studies in profertility series. vol. 4, p. 27, The Parthenon Pub. New York, 1996.
23. Marshburn PB: The role of antisperm antibodies in infertility. Fertil Steril, 61: 799-811, 1994.
24. Anderson DJ: Cell-mediated immunity and inflammatory processes in male infertility. Arch Immunol Ther Exp, 38: 79-85, 1990.
25. Dimitrov DG, Sedlak R, Nouza K, et al: A quantitativa objective method for the evaluation of antisperm cell mediated immunity in humans. J Immunol Methods, 154: 147-153, 1992.
26. Aitken J, Fisher H: reactive oxygen species generation and human spermatozoa: the balance of benefit and risk. Bioessays, 16: 259-264, 1994.
27. Asch R, Simerly C, Ord T, et al: The stages at which human fertilization arrests: microtubule and chromosome configurations in inseminated oocytes which failed to complete fertilization and development in humans. Hum Reprod, 10: 1897-1906, 1995.
28. Navara C, First N, Schatten G: Microtubule organization in the cow during fertilization, polyspermy, parthenogenesis and nuclear transfer: the role of the sperm aster. Devel Biol, 162: 29-40, 1994.
29. Bar-Chama N, Lamb DJ: Evaluation of sperm function: what is available in the modern andrology laboratory?. Urol Clin North Am, 21: 433-446, 1994.
30. Horbay GLA, Cowell CA, Casper RF: Multiple follicular recruitment and intrauterine insemination outcomes compared by age and diagnosis. Hum Reprod, 6: 947-952, 1991.
31. Horvath P, Bohrer M, Sheldon R, et al: The relationship of sperm parameters to cycle fecundity in superovulated women undergoing intrauterine insemination. Fertil Steril, 52: 288-294, 1989.
32. Riedel HH, Hübner F, Ensslen SC, et al: Minimal andrological requirements for in-vitro fertilization. Hum Reprod, 4(suppl): 73-77, 1989.
33. Edwards RG, Fishel SB, Cohen J, Fehilly CB, et al: J In Vitro Fert Embryo Transf, 1: 3-23, 1984.
34. Van der Zwalmen P, Bertin-Segal G, Geerts L, et al: Sperm morphology and IVF pregnancy ratecomparison between Percoll gradient cetrifugation and swim-up procedure. Hum Reprod, 6: 581-588, 1991.
35. Schlegel PN: Management of ejaculatory duct obstruction. In: Infertility in the male. Lipshultz LI, Howards SS (eds), 3th ed., p: 385-394, Mosby-Year Book, Inc, Missouri, 1997.
36. Colpi GM, Negri L, Mariani ME, Aydos K, et al: Male distal genital tract ultrasonography in excretory infertility. Prog Reprod Biol Med, 15: 119-129, 1992.
37. Schoysman R, van de Casseye M: Epididymal oligospermia, in. Microsurgery of male infertility, Schoysman R (ed), s. 249-254, Fondazione per gli studi sulla riproduzione umana, Palermo, 1994.
38. Schoysman R: Microsurgery of male infertility. Fondazione per gli studi sulla riproduzione umana, Palermo, 1994.
39. Van Steirteghem AV, Nagy P, Joris H, et al: Results of intracytoplasmic sperm injection with ejaculated, fresh and frozen-thawed epididymal and testicular spermatozoa. Hum Reprod, 13(suppl 1): 134-142, 1998.
40. Devroey P: ICSI with testicular sperm: techniques for retrieval in obstructive and non-obstructive azoospermia. Treatment of infertility: the new frontiers. Filicori M, Flamigni C (eds), Communications media for education, New Jersey, 1998.
41. Antinori S, Versaci C, Dani G, et al: Fertilization with human testicular spermatids: four successful pregnancies. Hum Reprod, 12: 286-291, 1997.
42. Silber SJ, Johnson L: Are spermatid injections of any clinical value ? Hum Reprod, 13: 509-523, 1998.
43. Vanderzwalmen P, Nijs M, Schoysman R, et al: The problems of spermatid microinjection in the human: the need for an accurate morphological approach and selective methods for viable and normal cells. Hum Reprod, 13: 515-519, 1998.
44. Tesarik J, Greco E, Mendoza C: ROSI, instructions for use: 1997 update. Hum Reprod, 13: 519-523, 1998.
45. Gandini L, Lenzi A, Lombardo F, et al: Immature germ cell separation using a discontinuous Percoll gradient technique in human semen. Hum Reprod, 14: 1022-1027, 1999.
46. Schlegel PN, Su LM: Physiological consequences of testicular sperm extraction. Hum Reprod, 12: 1688-1692, 1997.
47. Verheyan G, De Croo I, Tournaye H, et al: Comparison of four mechanical methods to retrieve spermatozoa from testicular tissue. Hum Reprod, 10: 2956-2959, 1995.
48. Crabbe E, Verheyen G, Silber S, et al: Enzymatic digestion of testicular tissue may rescue the intracytoplasmic sperm injection cycle in some patients with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod, 13: 2791-2796, 1998.
49. Bertin G, Nijs M, Vandamme B, Vanderzwalmen P: Laboratory methods in medically assisted procreation. Schoysman infertility management foundation, Vilvoorde, Belgium, 1997.
50. Nagy ZP, Verheyen G, Tournaye H, et al: An improved treatment procedure for testicular biopsy specimens offers more efficient sperm recovery: case series. Fertil Steril, 68: 376-379, 1997.
51. Tesarik J, Greco E, Rienzi L, et al: Differentiation of spermatogenetic cells during in-vitro culture of testicular biopsy samples from patients with obstructive azoospermia: effect of recombinant follicle stimulating hormone. Hum Reprod, 13: 2772-2781, 1998.
52. Elder K, Elliot T: The use of testicular and epididymal sperm in IVF: culture of testicular sperm. World wide conferences on reproductive biology. p. 46-49, Ladybrook pub., MAD print and delivery, Morley, West Australia 6062, 1998.
53. Fischer R, Baukloh V, Naether OGJ, et al: Pregnancy after intracytoplasmic sperm injection of spermatozoa extracted from frozen-thawed testicular biopsy. Hum reprod, 11: 2197-2199, 1996.
54. Anafarta K, Yaman Ö: Erkek cinsel işlev bozuklukları: etyopatogenez ve tanı. Temel Üroloji, ed: Anafarta K, Göğüş O, Bedük Y, Arıkan N. s. 1043-1084, Güneş Kitabevi, Ankara, 1998.
55. Steers WD: Neurol control of penile erection. Semin Urol, 8: 66-70, 1990.
56. Verheyen G, De Croo I, Tournaye H, et al: Comparison of four mechanical methods to retrieve spermatozoa from testicular tissue. Hum Reprod, 10: 2956-2959, 1995.
57. Tournaye H, Joris H, Verheyen G, Camus M, Devroey P, Van Steirteghem: Sperm parameters, globozoospermia, necrozoospermia and ICSI outcome. Treatment of infertility: the new frontiers. Filicori M, Flamigni C (eds), Communications media for education, New Jersey, 1998.
58. Flaherty SP, Payne D, Swann NJ, Matthews CD: Aetiology of failed and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, 10: 2623-2629, 1995.
59. Liu J, Nagy ZP, Joris H, et al: Analysis of 76 total-fertilization-failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles. Hum reprod, 10: 2630-2636, 1995.
60. Nagy ZP, Liu J, joris H, et al: The results of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Hum reprod, 10: 1123-1129, 1995.
61. Liu J, Van Steirteghem AC, Nagy Z, et al: Successful fertilisation and establishment of pregnancies in patients with round-headed spermatozoa. Hum Reprod, 10: 626-629, 1995.
62. Rolf C, Cooper TG, Yeung CH, Nieschlag E: Antioxidant treatment of patients with asthenozoospermia or moderate oligoasthenozoospermia with high-dose vitamin C and vitamin E: a randomized placebo-controlled, double-blind study. Hum Reprod, 14: 1028-1033, 1999.
63. Khorram O, et al: Reproductive technologies for male infertility. J Clin Endocrinol Metab 86: 2373, 2001.
