Prof. Dr. Kaan AYDOS
İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)’nin 1992 yılında Palermo ve ark. tarafından uygulanarak ilk gebeliğin elde edilmesi, infertilite tedavisinde yeni bir dönem başlatmıştır. Hemen arkasından, obstrüktif azoospermi olgularında epididimden veya testislerden elde edilen spermatozoalar kullanılarak ICSI denemeleri başlamış ve başarılı sonuçlar bildirilmiştir. Ancak, primer testiküler yetmezliğe bağlı non-obstrüktif azoospermi olguları sperm elde edilmesindeki güçlükler nedeniyle en problemli olguları teşkil etmektedir. Testiküler sperm ekstraksiyonu (TESE) tekniğinde son yıllarda elde edilen ilerlemeler neticesinde bu olguların da %24-81’inda spermatozoa elde edilebilmekte ve %18 ile 38 arasında gebelik sağlanabilmektedir. Yine de testis biyopsilerinde total germinal aplazi ya da maturasyon arresti bulunan olguların %58-76’sında, konvansiyonel ayrıştırma yöntemleri ile sperm elde edilmesinde başarısız kalınmaktadır.
Alınan testis biyopsilerinde spermatozoa aranmasında mekanik ayrıştırma yöntemi kullanılmaktadır. Burada seminifer tubulilerin bazal membranları mekanik olarak parçalanarak, lümende bulunan az sayıdaki germ hücrelerinin ortama geçmeleri sağlanmaktadır. Bu sırada spermatozoaların yanısıra yuvarlak germ hücreleri, interstisiyel hücreler ve Sertoli hücreleri de açığa çıkmaktadır. Ancak işlem sırasında bir kısım hücreler parçalanmakta ve ortama dejenere olmuş hücre artıkları, serbest nukleuslar ve rezidü doku parçaları da çıkar. Bir kısım spermatozoa veya spermatid ise lümene dökülmeyerek halen Sertoli hücrelerine bağlı olarak kalabilmektedir.
Mekanik parçalamadan başka, testis dokusundan hücre elde etmede enzimatik ayrıştırma teknikleri de denenmiştir. Bu amaçla trypsin-Dnase, trypsin tip III, collagenase tip I ve collagenase tip IV kullanılmış ve başarılı sonuçlar bildirilmiştir. Başka amaçlarla enzimatik yöntemler kullanılarak hücre kültürü hazırlanan olgularda da kollajenazın canlı, matür hücreleri dokudan bir zarar vermeden ayrıştırdığı gösterilmiştir. Tip IV kollejenazın invivo çalışmalarda kullanılmasını destekleyen bir diğer faktör ise, bu enzimin aynı zamanda Sertoli hücrelerinden ve az miktarda peritubuler hücrelerden de salgılanıyor olmasıdır. Kollajenaz IV’ün germ hücrelerinin yer değiştirmesinde ve spermiasyon sırasında matür spermatozoaların lümene salınmasında rol oynayabileceği de ileri sürmektedir.
Testis dokusunda seminifer tubül bazal membranı ve ekstrasellüler matriksin proteazlar ile enzimatik olarak ayrıştırılmasının, lümene germ hücrelerinin dökülmesini sağlaması bakımından kullanılabileceği düşünülebilir.
Aşağıda bu faktörler göz önüne alınarak, kendi olgularımızda uyguladığımız standart bir TESE işleminin yapılma tekniği anlatılmaktadır.
Mikroskopik testiküler sperm ekstraksiyonu
Spermatik kordun ve skrotal cildin yüzeyel lokal anestezilerini takiben, skrotal kesi ile girilir. Tunika vajinalis açılarak o taraf testis dışarı alınır. Epididim ve vaz deferens obstrüktif bulgular ve konjenital anomaliler bakımından muayene edilir. 20 x büyütmeli ameliyat mikroskopu altında tunika albuginea üzerinde, avasküler bir alan seçilerek, ince bir bistüri ile 1.5-2 cm uzunluğunda transvers bir kesi yapılır. Damarlar koterize edilir. Mümkün olduğu kadar kansız bir ortamda çalışılmaya özen gösterilmelidir. Dışarı doğurulan testis dokusu incelenerek, seminifer tubuller mikrocerrahi aletleri kullanılarak muayene edilirler. Öncelikle, diğerlerinden farklı, dolgun, geniş ve opak seminifer tubüller ayırd edilerek, gerekli minimum doku çıkarılır ve içerisinde, aşağıda içeriği açıklanan ya da sperm yıkanması amaçlı hazır sperm inkübasyon mediumu bulunan konik tabanlı bir tüp içerisine alınır. Androloji laboratuvarında bir Petri kutusuna nakledilen doku örneği, stereomikroskop altında tubüller disseke edildikten sonra inverted mikroskop ile (x320 büyütme) spermatozoa varlığı yönünden tetkik edilir. Hücre bulunamaması durumunda örneklemeye devam edilir. Hücre arama işlemlerine, aynı kesiden ya da diğer kesilerden alınan doku örneklerinde hücre bulunana kadar devam edilir. Gerekirse diğer testis de araştırılır. Tubüllerin hepsinin de sklerotik olduğu ve/veya diğerlerinden ayırd edilemediği durumlarda 0.5×0.5 cm testis dokusu randomize olarak seçilerek incelenmek üzere çıkarılır. Spermatozoa bulunduğu zaman yada bulunamaması durumunda yeteri kadar doku çıkarıldığına karar verildikten sonra tunika albuginea 5/0 sütür ile kapatılır.
Mekanik ayrıştırma yöntemi
Bu şekilde laboratuvarda toplanan dokular, içerisinde 4 ml kültür ortamı (modifiye Eagle’s MEM mediumu, Sigma M2289; 15 mM HEPES, Sigma H6147; 1 mM pyruvic asid, Sigma P4562; 6 nM L-laktik asit, Sigma L7022; glutamin, Sigma G5763; 100 IU/ml penisilin, Sigma P4687; 100 mg/ml streptomisin, Sigma S1217; %10 (v/v) human serum albumin) bulunan Petri kutusu içerisinde önce stereomikroskop altında iki küçük iğne yardımıyla gerilerek parçalanır. Bu sırada mümkün olduğu kadar tüm tübüllerin parçalanması sağlanmalı, yeteri kadar zaman ayrılmalıdır. Spermatozoa görülmesi durumunda elde edilen eriyik, konik tabanlı 15 ml Falcon tüp içerisine alınarak 1 dk süreyle vorteksleme işlemine tabi tutulur. Daha sonra 450 x g hızda 20 dk süreyle santrifüj edilir. Üstte kalan sıvı kısım bir pipet yardımıyla dışarı atılarak, dipte toplanan pelletin üzerine 1 ml medium konulur ve inkübasyona bırakılır. Eğer ICSI işlemi aynı gün yapılacaksa, süspansiyon 37oC’da %5 CO2 ortamında en az 1 saat inkübe edilir. Ancak, özellikle nonobstrüktif azoospermi olgularında gereksiz oosit toplanması işleminden kaçınmak için, TESE’yi 24 saat önceden yapmak daha doğru olur. Bu durumda, spermatozoaların hareketini stimüle ederek fazla enerji harcamalarına mani olmak için, hazırlanan süspansiyon tüpü oda ısısında 22-24oC’da ertesi güne kadar bekletilebilir. Daha sonra üstten başlıyarak bir pipet yardımıyla alınan sıvı, ICSI dish’ine uygun şekilde yerleştirilerek mikromanipülasyona geçilir.
Enzimatik ayrıştırma işlemi
Mekanik ayrıştırma ile spermatozoa görülemeyen olgularda, petri kutusundan alınan doku süspansiyonu, daha önce 37oC’a ısıtılmış enzim içeren 1 ml inkübasyon mediumu ile karıştırılarak bir Falkon tüp içerisine alınır ve 37oC’da, %5 CO2 ortamında 1 saat süreyle inkübe edilir. Burada kullanılan medium %1 HSA içeren HEPES’li Earle’s mediumu içine, 2.6 mg kollajenaz tip IV (Sigma C5138) ve ölü hücrelerden açığa çıkacak serbest DNA’ya bağlı hücre süspansiyonundaki pıhtılaşmayı önlemek amacıyla 25 mg/ml Dnase (Sigma DN25) konularak hazırlanır. İnkübasyon işlemi tamamlandıktan sonra solüsyon ya 15-30 dk süreyle kendi halinde bekletilerek ya da 50 x g’de 5 dk santrifüj edilerek arta kalan doku parçalarının çökmesi sağlanılır. Üstteki kısım ayrı bir tüp içerisine alınır ve 400 x g’de 5 dk süreyle tekrar santrifüj edilerek, dipte toplanan pellet kısmı inverted mikroskop altında incelenir. Bir önceki kademede tüpün dibinde kalan pellet kesinlikle atılmamalıdır. Çünkü eğer süspansiyon içinde spermatozoa görülmezse, pellet incelenerek arada kalmış spermatozoaların varlığı araştırılmalıdır. Hücre varlığı durumunda, yukarıda anlatıldığı şekilde ICSI için hazırlanır.
Ancak, kullanılan enzimlerin spermlerin fertilizasyon potansiyelleri üzerine etkileri tam olarak ortaya konmadığı için, TESE işleminin öncelikle en az travmatik olacak şekilde mekanik yöntemle yapılması, bununla hücre elde edilemediği durumda ortama enzim ilave edilerek devam edilmesi uygun olacaktır. Bizim tecrübelerimiz, nonobstrüktif azoospermi olgularında motil spermatozoa elde etme oranının mekanik yöntem kullanıldığında %39 olduğunu ortaya koymuştur. Ama mekanik yöntemle hücre göremediğimiz olgularda işleme enzim eklenilerek devam edilmesi durumunda ise %19 olguda daha spermatozoa bulunabileceğini göstermiştir.
