Prof.Dr. Kaan AYDOS
Çocuk sahibi olamama, evli çiftlerin yaklaşık %15’ini meşgul eden bir sorundur. Eğer ejakulatta sperm hücreleri bulunuyorsa bunların üremeye yardımcı tekniklerde kullanılması sonucu ailelerin yaklaşık yarısında gebelik sağlanabilinir. Ancak bir grup olgu var ki, bunların ejakulatlarında sperm bulunamamakta ve testiküler sperm ekstraksiyonu (TESE) yöntemi ile testislerden cerrahi olarak elde edilen hücreler kullanılarak fertilizasyon ve gebelik elde edilebilmektedir.
Sorun testislerin çalışmasındaki bir problemden kaynaklanıyorsa 2 önemli durum söz konusu olabilir: 1) germ hücreleri gelişimlerinin bir evresinde duraklamışlardır; ya da 2) hiç germ hücresi gelişmemiştir (Sertoli cell only sendromu veya germinal aplazi). Her ne kadar bunlarda da TESE ile ameliyat sonrası sağlıklı hücre elde edilebilmekteyse de, önemli bir kısım erkeğin bu şansı da olmamaktadır. İşte günümüz tıbbı artık böyle komplike olguların tedavisine yönelik araştırmalar içerisine girmiştir. Kök hücre tekniği bu araştırmalarda önemli bir yer tutar.
Kök hücreler vücutta bulunan organları oluşturan temel hücrelerdir. Embriyonun gelişimi sırasında aktif halde çoğalarak, hedef edindikleri dokuları ve bunlardan da organları yaparlar. Doğumdan sonra da bazı hastalık durumlarında, ya da ihtiyaç ortaya çıktığında tekrar aktifleşerek çoğalmaya ve bozulmuş dokunun yenilenmesine çalışırlar. Erişkin kök hücresinin kaynağı kemik iliğidir. Buradan çıkan hücreler periferik kana karışarak, ilgili dokuya ulaşırlar ve burada görevlerini yerine getirirler. Bu kök hücreleri elde ettikten sonra, hasarlı olan organın içerisine vererek, sağlıklı hücrelerin oluşmasını ve dolayısıyla bozulmuş fonksiyonunu tedavi etmek günümüz teknolojisi ile mümkün olabilmektedir. Günümüzde kök hücreler kullanılarak tedavileri sağlanmış organlar kalp kası (kardiyomiyositler), karaciğer dokusu (hepatositler), kemik dokusu (osteositler) ve sinir dokusudur (glial hücreler ve nöronlar). Yakın tarihte, testislerde de bir grup sprmatogoniumun kök hücre olarak görev yaptığı ortaya konmuştur. Eğer bu hücreler yeteri kadar izole edilebilirlerse, diğer testislerde de spermatogenezi sağlayabilmektedirler (1,2).
Kök hücreler 1) erişkinlerde kemik iliğinden; 2) embriyo hücrelerinden; ve 3) kordon kanından (umblikal kord) elde edilebilirler. Bunlarda sorun, başkasının kök hücrelerinin kullanılması durumunda vücudun bu hücreleri reddetmesidir. Bu nedenle kişinin kendi kök hücrelerinin kullanılması daha geçerlidir. Örneğin çocuk doğduğunda umblikal kord (göbek kordonu) kanı alınır ve içerisindeki kök hücreler ayrıştırılarak saklanırsa, çocuk erişkin yaşa geldiğinde bu hücreleri kullanılarak bazı hastalıkları tedavi edilebilir. Doku uyumluluğu gösterilmiş olan kardeşler arasında da kök hücre nakli başarılabilmektedir. Bir diğer alternatif de, kendi kemik iliğinden alınan kök hücrelerin kullanılmasıdır.
İşte bu yeni teknolojinin infertilite tedavisinde de kullanılması cazip bir yaklaşım olarak görülmektedir. Erkeklerde üreme hücrelerinin kök hücreleri testislerde bulunan spermatogoniumlar‘dır. Spermatogoniumlar fötus daha ilk ayında iken oluşur, testislerde yerlerini alır ve doğumdan sonra da çoğalmalarına devam ederler. Eğer çoğalmalarını engelleyen bir durum söz konusuysa, azoospermi ortaya çıkar. Germinal aplazi ya da maturasyon duraklaması durumlarında böyle bir sorun mevcut olabilir.
İşte, çoğalma yeteneğini kaybetmiş bu kök spermatogoniumları acaba tedavi edebilirmiyiz? Yakın zamanda yapılan deneysel çalışmalar bunun mümkün olabileceği yönünde sinyaller vermektedir. Buradan yola çıkan araştırıcılar, infertil erkeğin testis dokusundan bir parça alarak içerisinden kök spermatogoniumların elde edilebileceğini ortaya koymuşlardır. Acaba bu hücreleri kendi ya da donör amaçlı bir başka erkeğin testislerine nakledersek, yeniden çoğalmalarını sağlayabilirmiyiz?
Kök üreme hücreleri olan spermatogoniumların çoğalmasındaki sorunun aslında hücrenin kendinde olmayıp, bunları destekleyen civar hücrelere ait olduğunu ortaya konmuştur. Bu destek hücreleri (Sertoli hücreleri) genetik olarak bozuk hayvanlarda, üreme kapasiteleri olmayan spermatogoniumların, sağlıklı hayvanlara nakledilmeleri durumunda (taşıyıcı baba!) normal çoğalmalarını başarabildikleri ve hatta bunlardan yavru bile doğabildiği gösterilmiştir (3,4). Bu önemli bir sonuçtur, çünkü ilk defa infertil bir canlıda, önceden çoğalmalarının mümkün olmadığına inanılan hücrelerinin aslında çoğalabilecekleri ve yavru yapabileceği gösterilmiştir.
Kök hücreler (stem cell), hayat boyunca kendi kendilerini yenileyerek, farklılaşma kapasitesine sahip yeni hücre serileri (progenitör hücreler) üreten hücrelerdir. Bu hücre serileri de daha ileri farklılaşmaya uğrayarak, dokuya özgü fonksiyonları olan özgül hücreleri meydana getirirler. Özellikle kemik iliği, epidermis, barsak epiteli ve spermatogenez gibi sistemler, kök hücreler sayesinde kendilerini sürekli olarak yenilerler.
Testislerde spermatozoanın oluşumunda kullanılan kök hücre ise spermatogonium’dur. Spermatogonial kök hücreler vücutta bölünerek ileri jenerasyonlara gen nakledebilen tek hücre grubu olması nedeniyle özellik gösterir. Bununla birlikte, testislerde seminifer tubüller içerisinde yer alan spermatogonial kök hücreler, fetus henüz 3 haftalık iken yolk kesesi (ilkel sindirim sistemi) endoderminden kaynaklanan ilk germ hücre serisi olan primordial germ hücrelerinden morfolojik olarak farklı bir görünüme sahiptirler ve “prospermatogonium” adını alırlar. Dolayısıyla bu hücreler tek yönlü olarak germ hücre serisine farklılaşma özelliği taşımaktadırlar.
Spermatogoniumların eksperimental ortamda uygun şartlar sağlandığında daha ileri farklılaşma göstererek spermatosit ve spermatozoa’ya farklılaşıyor olmaları, germ hücre transplantasyonu için bir umut doğurmuştur. Daha da ilginci, germ hücre transplantasyonunun son zamanlarda ortaya konulan bir diğer kullanım alanıdır. Buna göre, “multipotent adult germline stem cells (maGSCs)” olarak adlandırılan, testislerden izole edilmiş bir grup spermatogonium populasyonu tanımlanmıştır (5). maGSCs, embriyonun 3 tabakasını da oluşturacak şekilde farklılaşabilme kapasitesine sahiptir. Dolayısıyla bu spermatogonium hücreleri, embriyonik kök hücreler gibi etik ya da immünolojik bir problem yaratmaksızın, kök hücre tedavisinde ümit vermektedir. Testiküler kök hücrelerin multipotansiyel kapasiteleri, testis dokusunda Anterior gradient-2, BMP, Epimorphin, Flightless, Frizzled, Notch, Tiarin, Twisted gastrulation ve Wnt gibi morfogenlerin varlığının gösterilmesiyle daha da vurgulanır duruma gelmiştir (6). Bilindiği gibi morfogenler, vücudun doku şekillenmesi ve büyümesi işlevlerinde rol alan gelişimsel regülatörlerdir. Vücuttaki ortak morfogenlerin tesiste de bulunması, testiküler kök hücrelerin hayati öneme sahip olabilecekleri konusunda destek sağlamaktadır.
Mezanşimal hücrelerin kas, sinir dokusu gibi farklılaşmaları üzerine, aynı mezanşimal kök hücrelerin acaba testislerde de germ serisine ait kök hücrelere farklılaşma potansiyellerinin olup olmadığı düşünülebilir. Hemopoetik seri “side population” hücreleri ile testislerde spermatogonial bir grup hücre, ortak Bcrp1 gen ekspresyonu göstermektedirler (7). Her ne kadar kemik iliği transplantasyonunu takiben değişik oranlarda spermatogenez yeniden başlayabilmekteyse de (8), mezanşimal hücrelerin germ serisi kök hücreler ile ilişkisi gösterilmiş değildir. Yakın tarihli eksperimental bir çalışmada, işaretlenmiş kemik iliği mezanşimal kök hücreleri izole edilerek ksenogenik fare testisine transplante edilmiştir. Sonuçta bu hücrelerin testiste canlılığını sürdürebileceği gösterilmiş, ama herhangi bir farklılaşma izlenmemiştir (9).
Spermatogonium transplantasyonu günümüzde eksperimental temelde geniş olarak araştırılmaktadır. Bu teknikten beklenilen yararlar 1) spermatogenezin daha iyi anlaşılabilmesi; 2) transgenetik hayvanların elde edilmesi; ve 3) erkek infertilitesinin tedavisidir.
Sağlıklı genlerin taşıyıvı bir hücre (vektör) içerisinde hastalıklı organa nakledilmeleri, bazı hastalıkların tedavisinde umut vermektedir. İşte, spermatogoniumların transplante edilmelerinden önce germ hücreleri içerisine bazı genlerin katılması (transfeksiyon) da, gen naklinde önemli bir aşama olacaktır. Bu konuda henüz az sayıda çalışma mevcuttur.
Primodial germ hücreleri içerisine gen nakli için çeşitli metodlar tanımlanmıştır. Bu amaçla elektroporasyon yapılmış ama, germ hücrelerinde ciddi hasar meydana getirdiği gözlenmiştir (10). Lipozom aracılığıyla transfeksiyonun ise etkinliği düşük bulunmuştur. Bir diğer gen nakil yöntemi olan CaPO4 kopresipitasyon metodu %18’lik transfeksiyon etkinliği ile en iyi sonuç veren yöntem özelliğindedir. Bu yöntemle tip B spermatogonium, spermatosit ve spermatidlere başarılı gen aşılamaları yapılabilmiştir (11).
VAD rat testislerinden farklılaşmamış tip A spermatogoniumların izole edilerek plazmid pCMV-SPORT-b gal ile transfeksiyonundan sonra X-gal boyası ile transfeksiyonun etkinliği analiz edildiğinde, bu spermatogoniumlar ile transfeksiyonun gerçekleştirilebileceği ama henüz başarısının düşük kaldığı gözlemlenmiştir. Cell fectin ve Fuegene 6 metoduyla transfeksiyonu başarılabilmiş tip A spermatogonium oranları da %1 ile %2.8 arasında kalmaktadır. Transfeksiyonda viral vektörlerin kullanılması (12) ya da transfekte edilen gene bir sinyal peptidinin bağlanması (13), gen naklini daha etkin kılabilir.
Aslında erkek infertilitesinde spermatogonium transplantasyonunun esas kullanım amacı, kemoterapi ve radyoterapi öncesi kök hücrelerin saklanarak, daha sonra tekrar testislere nakledilmesi ve böylece üremesinin devam ettirilebilmesi beklentisidir. Bu yöntemin mevcut sperm bankası uygulamasına üstünlüğü, testislerde sürekli spermatogenezin sağlanabilmesidir.
Testislerde kök hücre transplantasyonu teknik olarak bazı basamakları gerektirir. Bunlar spermatogonial kök hücrelerin izolasyonu, saklanması, isteniyorsa içine farklı genlerin transfeksiyonu, alıcı testisin hazırlanması ve nihayet hücrelerin transplante edilmesi yöntemleridir. Temelde, testis doku ekstrelerinden izole edilen spermatogonial kök hücreler, alıcı testiste seminifer tubüller içerisine, efferent kanallar ya da rete testis yoluyla enjekte edilirler. Enjeksiyonu takiben bu hücreler, donör genetik yapısında germ hücre üretimini başlatabilirler.
Spermatogonium izolasyonu konusunda çok sayıda eksperimental çalışma bildirilmiştir. Bunlar arasında yakın tarihli bir uygulamada, testis dokusu STO feeder üzerinde inkübe edildiğinde 8-21 gün sonra ilk hücre kolonisinin oluştuğu gözlenmiştir. Daha sonra 7ml solüsyon içerisinde 107/ml hücrenin alıcı farenin testisinin rete testis bölgesinden seminifer tubüller içerisine enjekte edilmesini takiben 2 ay sonra testisde spermatogenezin başladığı açıkça gözlenmiştir (14). Ratlarda, izole edilen spermatogonial kök hücreler kültür ortamında 3-4 gün içerisinde sayılarını iki katına çıkarmakta, alıcı testise nakledildiklerinde ise spermatide kadar farklılaşabilmektedirler (15). 12 pasaja kadar da öploid kalabilmektedirler. Hatta aynı hücreler plazmid ile transfekte edildiklerinde, alıcı testisi kolonize edebilmektedirler. Son olarak keçilerde yapılan çalışmalarda da, donör kök spermatogoniumunun alıcı testiste spermatogenezi başlattığı ve neticede yavru doğumu ile sonuçlandığı gösterilmiştir (16).
Sadece aynı türde değil, farklı türler arasında da kök hücre nakilleri başarılı olmuştur (17). Örneğin rat kök hücreleri fare testislerinde seminifer tubüller içerisine transplante edildiklerinde germ hücre çoğalması başarılmıştır. Benzer şekilde, hamster kök hücreleri de fare testisine başarıyla nakledilmiştir. Bu çalışmalar, değişik türlere ait spermatogonial kök hücrelerinin transplantasyonlarının mümkün olabileceğini ortaya koymaktadır (xenogeneic spermatogenez). Tavşan spermatogoniumlarının, spermatogenezi bloke edilmiş fare testisine nakledilmesiyle de spermatogenezin %90 oranında başladığı, hatta bu hücreler ile IVF yapıldığında, anne tavşanın kendi genetik yapısında yavru doğurduğu görülmüştür (18).
İnsanda, türler arası germ hücrelerinin transplantasyonu başarılı sonuçlar vermemiştir (19). İnsanda testis biyopsilerinden ya da orkiektomi materyallerinden izole edilen spermatogonium, spermatosit ve spermatidlerden oluşan miks hücre populasyonları W/Wv fare testislerine (sadece birkaç primitif evre germ hücrelerinin bulunduğu steril fareler) transfer edilmişlerdir. Bu şekilde insan donör germ hücrelerinin enjeksiyonu yapılan fareler, 48-230 gün takip edildiklerinde, farelerin testisleri içerisinde son maturasyon evresine ulaşabilen spermatogenez yeniden başlatılamamıştır (20). İnsan spermatogoniumunun başka hayvanlara transplantasyonunun başarılı olabilmesi için, uygun bir alıcı hayvan türünün bulunması gerekmektedir.
Ancak, yakın tarihte insan spermatogonial kök hücrelerinin fare testislerine nakledildiklerinde, uzun süre çoğalarak canlılıklarını devam ettirdikleri izlenmiştir (21). Alıcı testislerin %73’ünde donör spermatogoniumların sağlıklı biçimde çoğalabildikleri ve 6 ay canlı kalabildikleri ortaya konmuştur. Ne yazık ki, burada farklılaşmamış spermatogonial kök hücreler 1 ay sonra farklılaşmışlarsa da, daha ileri basamaklara geçememişler, mayozu oluşturamamışlar ve neticede olasılıkla apopitoza uğramışlardır.
Ancak bu çalışmalardan bazı önemli sonuçlar da elde edilmiştir: 1) nakledilen insan spermatogoniumları fare Sertoli hücreleri tarafından tanınmaktadırlar; 2) nakledilen hücreler doğru yere göç ederek seminifer tubüller içerisinde bazal membran üzerinde yerlerini almaktadır; 3) kısa süreli de olsa çoğalabilmekte; ve 4) bir kısım kök hücre 6 ay süreyle yaşayabilmektedir. Belki insan kaynaklı bazı büyüme faktörlerinin ya da insan Sertoli hücrelerinin de alıcı testis içerisine verilmeleri, sonucu daha başarılı hale getirebilecektir.
Yukarıda da belirtildiği gibi, insanda spermatogonium transplantasyonunda iki yarar söz konusu olabilir. Birincisi; sitotoksik tedavi alacak erkeklerin spermatogonial kök hücreleri ileride tekrar nakledilmek üzere dondurularak saklanabilir; ikincisi ise alıcı testise nakledilen erkeklerin germ hücreleri belki daha uygun bir ortama geçmiş oldukları için, daha sağlıklı çoğalarak mayoza girebilir ve burada olgunlaştıktan sonra alınarak ICSI ile erkeğin kendi çocuğu doğurtulabilir.
Birinci şık günümüzde gerçekleştirilmiştir. Hayvanlarda, kök spermatogoniumlar dondurulup bir süre saklandıktan sonra tekrar aynı hayvan testisine nakledildiklerinde, üreme hücrelerinin yeterli ölçüde çoğalabildikleri ortaya konmuştur. İnsanda kanser tedavisi öncesi alınan testis dokularının daha sonra otolog transplantasyonu başarıyla yapılmıştır (22). Bu son derece önemlidir. Çünkü testis tümörü ya da malign kan hastalıklarının yüksek oranda başarıyla sonuçlanan tedavileri vardır. Ama bu tedavilerin en önemli yan etkisi testislerde kalıcı hasar meydana getirerek infertiliteye yol açmalarıdır. Eğer bu tedavilere başlanmadan önce testislerdeki kök spermatogoniumlar alınıp, dondurularak saklanırsa, ileride tekrar aynı testis içine verilerek çoğalmaları beklenebilir. Böylece bozulmuş fertilte de tedavi edilmiş olunur.
İkinci şık için ise, belki fazla abartılı gibi görülebilir, ama Nagano ve ark. da yorumlarında benzer sonuçlara işaret etmektedirler (23). Aynı tür hayvanlarda yapılan çalışmalarda, infertilitenin bu yöntemle tedavi edilebileceği ortaya konmuştur. İnfertil fare testisinden alınan kök germ hücreleri diğer infertil fareye nakledildikten 4 ay sonra bu hücreler farklılaşabilmekte ve çoğalarak koloniler halinde spermatogenezi başlatabilmektedirler (24). Daha sonraki aşamalarda, mayozun başladığı ve bunun üstüne fertilizasyonun da sağlanabildiği gösterilmiştir (4). Daha önce belirtildiği gibi, burada infertil hayvanda infertilite nedeni germ hücrelerine destek sağlayan çevre dokulardaki bir problem olabilir ve bu nedenle germ hücreleri testiküler ortamı sağlıklı hayvana nakledildiğinde fertilizasyon kapasitelerini tekrar kazanmış olabilirler.
Erkek germ hücrelerinin aynı tür ya da türler arası nakli eksperimental temelde, yaklaşık 10 yıldır üzerinde çalışılan ilginç bir konu olma özelliğindedir. 1994’de Brinster ve Zimmermann erkek stem hücrelerinin steril farelerde seminifer tubüller içerisine enjeksiyonlarını takiben testisde tekrar çoğalabileceklerini göstermişlerdir (25). Hatta bu yöntem ile fertil spermatozoalar bile elde edebilmişlerdir. Kolonizasyon, normal spermatogenezdeki kompleks hücre birlikteliğinin rekonstrüksiyonunda daima ümit verici bir ilgi alanı olmuştur. Nihayet, rat stem hücrelerinin fare seminifer tubüllerinde kolonize olup olmayacakları araştırılır hale gelmiştir.
Ratlardan alınan hücreler immün yetmezlikli fare testislerine transplante edildiğinde, farelerin epididimlerinde 110 günden sonraki bazı hayvanlarda normal morfolojide rat spermatozoaları elde edilmiştir (26). Bir fare testisi içerisinde rat spermatogenezinin görülmesi, başka türlere ait stem hücrelerinin transplante edilebileceğini ispatlamış olup, insanda da stem hücreler kullanılarak xenogeneic spermatogenezisin başarılabileceği ümidini doğurmuştur. Maymunda da otolog spermatogonial transplantasyonu takiben 4. haftada seminifer tubüller içerisinde spermatogenezis yeniden başlatılmıştır (27).
İnsan spermatogoniumlarının xenogeneic transplantasyonu ICSI ile birlikte uygulandığında, mayotik veya post-mayotik germ hücrelerinin kullanılmasına alternatif bir tedavi modeli olarak görülebilir. Örneğin, radyasyon sırasında veya kemoterapi verilirken hücre proliferasyonunun supresyonu ile stem hücrelerinin sensitivitesinin azaltılması amacıyla hormonal baskılama yöntemi her zaman başarılı olmamaktadır. Böyle olgularda germ hücrelerinin alınarak bunların sonradan seminifer tubüller içerisine yeniden verilmeleri, germinal epitelyumun yeniden hayatiyete geçirilmesinde, özellikle puberte öncesi hastalarda, potansiyel değerli bir yöntem olabilir.
Bir diğer husus ise insan spermatogenezinin bu işlem için yeterliliğidir. Çoğu hayvan ile karşılaştırıldığında insanda bu yeterlilik, muhtemelen spermatogenezin uzun sürmesi, germ hücre konsantrasyonunun düşüklüğü ve seminifer tubüllerin kapladığı testis yüzdesinin azlığı nedenleriyle, kısmen daha azdır. Ayrıca insanda, özellikle ikinci mayoz sırasında %36-45’lere varan önemli ölçüde germ hücre dejenerasyonu olmaktadır.
Her ne kadar insan spermatogoniumunun fare testisine transplantasyonu başarılmayı beklemekteyse de, bunun gerçekleşmesi insan spermatogenezinin araştırılmasında, kemoterapi veya radyoterapiye giren erkeklerde fertilitenin korunabilmesinde ve maturasyon duraklamalı olguların kesin tedavilerinde değerli bir teknik olabilir. Ayrıca, aynı ratlarda olduğu gibi insanda da spermatogoniumlar dondurularak saklanabilir ve bu teknik kullanılarak ileride gebelik sağlanılabilir. Örneğin kemoterapi sonrasında olduğu gibi, germ hücrelerini kaybetme tehlikesi ile karşı karşıya kalan erkeklerde dondurularak saklanan spermatogoniumların radyasyon uygulanmış testis içerisinde yeniden kolonizasyonu yapılarak elde edilecek spermatidler, ileride ICSI’de kullanılabileceklerdir de.
İnsanda bir diğer tedavi yaklaşımı ise, nonobstrüktif azoospermi olgularında kök hücrelerden matür sperm elde edilmesi olabilir. Gerçekten de Lee ve ark, nonobstrüktif azoospermi olgularında testislerden elde ettikleri germ kök hücre benzeri hücreleri kültür ortamında salkıyarak, 6 hafta içinde haploid spermatidleri oluşturabilmişlerdir (28). Bu spermatidler oosit içine enjekte edildiğinde klivaj evresine kadar ilerleme gösterilmiştir.
Kök hücre transplantasyonu konusunda en önemli engel imprinting zamanlaması olarak görülebilir (imprinting: anneden ve babadan çocuğa geçen genlerin bir kısmının baskılanmasıdır. Bu olay çocuğun normal gelişimi için gereklidir. Gerçekleşmemesi durumunda bazı önemli hastalıklar ortaya çıkabilir). Bilindiği gibi, diploid hücrelerde allellerin eksklusyonu, bazı genlerin iki allelinden birinin inaktivasyonuyla sonuçlanmaktadır. Imprinting denilen maternal veya paternal allellerin bu şekilde inaktivasyonu olayı, DNA’larının sitozin rezidülerinin 5′ pozisyonunda metilasyonu sonucu gerçekleşen bir epigenetik modifikasyon şeklinde oluşmaktadır. Sessiz kalan gen yeniden aktive olduğu zaman demetilasyon yoluyla bu olay tersine dönebilir. Eksprese edilmedikleri dokuların çoğunda dokuya spesifik genler metillenmişlerdir, eksprese edildikleri dokularda ise bir modifikasyona uğramazlar. Tersine, 5′ CpG bölgesine bağlı evsahibi genler bütün dokularda metillenmemiş haldedirler. Metilasyon keza, kadın somatik hücrelerindeki inaktiv X kromozomu üzerinde bulunan genlerin represyonlarının idamesinde de rol alır.
Genomik imprinting normal gelişim için çok önemlidir. Gametogenez veya erken gelişim dönemi sırasında bozulması Prader-Willi ve Angelman sendromları gibi bazı genetik hastalıklara neden olabilir, ve çocukluk çağı malign tümörlerinin gelişimini uyarabilir. Memelilerin gelişiminde genomik imprinting’in önemi ilk olarak 1977’de anlaşılmıştır. Gen inaktivasyonu konusunda yapılan çalışmalarda kadında imprinte olan genlerin embriyonik büyümeyi, erkekte imprinte olan genlerin ise plasental büyümeyi sağladıkları ortaya konmuştur. Embriyo gelişiminin erken basamakları sırasında dramatik metilasyon değişikliklerinin oluştuğu gözlenmektedir. Erken blastomer DNA’larının çoğu metillenmemiştir, ve totipotensleri bununla ilgilidir. Ama, implantasyonu takiben yaygın bir de-novo metilasyon dalgası, evsahibi genler dışında genomun büyük kısmını değiştirir. Aberran metilasyon embriyo gelişimine zarar verir. Metiltransferaz ekspresyonu düşük olan bazı hayvanların embriyolarının miyadında gelişim gösteremedikleri gözlenmektedir. Diğer yandan, transgenic farelerde H19 geninin aşırı ekspresyonu geç dönem gestasyonel ölümlerine neden olmaktadır ve Snrpn gen (paternal imprinte olmuş allel) bölgesinde maternal duplikasyon farelerde postnatal ölümlere yol açmaktadır. Ayrıca, tümör supresor gen promotor’unun metilasyonu da tümör gelişimine katkıda bulunmaktadır.
Kök hücre naklinde, spermatogoniumlardan ileri evre ama tam matüre olmamış germ hücrelerinin oluşturulması mümkün olsa bile, imprinting başta olmak üzere, bazı problemlerin çözümlenmesi gerekir. Gametogenez sırasında imprinting olaylarının kesin zamanlaması tam kesinlik kazanmamış olmakla birlikte, bazı indirekt kanıtlar ileri sürülmektedir (29). ICSI’de immatür germ hücrelerinin kullanımı hangi evrelerde imprinting olayının inkomplet olduğunu ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. ROSI ile elde edilmiş olan fare embriyolarında, çok sayıda paternal ve maternal imprinte olmuş genlerin ekspresyonunda, kontrole göre bir fark bulunmadığı ortaya konmuştur. Her iki sekste de erken gelişim dönemlerinde germ hücrelerinde metilasyon farklılıkları gözlenmemiştir. Spermatogenez sırasında, muhtemelen primordial germ hücrelerinde veya replike olan gonositlerde, imprinting’de mayozdan önce silinme görülür. DNA metiltransferaz aktivitesine göre, imprinting’in tekrar gerçekleşmesinin geniş oranda preleptoten, leptoten ve zigoten evrelerinde ortaya çıkacağı savunulmaktadır. Ancak, yuvarlak spermatidlerde rezidü metiltransferaz aktivitesi bulgusu, imprinting’in yalnızca mayozdan sonra tamamlanabileceğini düşündürmektedir. Bunun bazı minör elementleri spermiasyondan sonra bile inkomplet kalabilir, çünkü Pgk-2, ApoA1 ve Oct-3/4 gibi genlerin metilasyonları spermin epididimden geçişi sırasında gözlenmektedir.
KAYNAKLAR
1. Le Bras S, Van Doren M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 2006 Mar 24; [Epub ahead of print]
2. Ogawa T, Ohmura M, Ohbo K. The niche for spermatogonial stem cells in the mammalian testis. Int J Hematol. 2005; 82: 381-8.
3. Kanatsu-Shinohara M: Allogeneic offspring produced by male germ line stem cell transplantation into infertile mouse testis. Biol Reprod. 2003; 68: 167-73.
4. Ogawa T. Dobrinski I, Avarbock M, Brinster R. Transplantation of male germ line stem cells restores fertility in infertile mice. Nature Medicine. 2000; 6, 29-34.
5. Guan K, Nayernia K, Maier LS, et al: Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature. 2006; 24: [Epub ahead of print]
6. von Schalburg KR, McCarthy SP, Rise ML, et al: Expression of morphogenic genes in mature ovarian and testicular tissues: potential stem-cell niche markers and patterning factors. Mol Reprod Dev. 2006; 73: 142-52.
7. Lassalle B, Bastos H, Louis JP, et al: ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 2004; 131: 479-87.
8. Jacob A, Barker H, Goodman A, Holmes J. Recovery of spermatogenesis following bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 1998; 22: 277-9.
9. Liu FH, Yang DZ, Wang YF, et al: Transplantation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells into the xenogeneic testis. Zhonghua Nan Ke Xue. 2005; 11: 499-502.
10. Watanabe M, Shirayoshi Y, Koshimizu U, et al: Gene transfection of mouse primordial germ cells in vitro and analysis of their survival and growth control. Exp Cell Res. 1997; 230: 76-83.
11. Hofmann MC, Hess RA, Goldberg E, Millan JL. Immortalized germ cells undergo meiosis in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91: 5533-7.
12. Kay MA, Liu D, Hoogerbrugge PM. Gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94: 12744-6.
13. Zanta MA, Belguise-Valladier P, Behr JP. Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 91-6.
14. Jeong D, McLean DJ, Griswold MD. Long-term culture and transplantation of murine testicular germ cells. J Androl. 2003; 24: 661-9.
15. Hamra FK, Chapman KM, Nguyen DM, et al: Self renewal, expansion, and transfection of rat spermatogonial stem cells in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 29: 17430-5.
16. Hill JR, Dobrinski I. Male germ cell transplantation in livestock. Reprod Fertil Dev. 2006; 18: 13-8.
17. Ogawa T, Dobrinski I, Avarbock MR, Brinster RL. Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster germ cells to mouse testes. Biol Reprod. 1999; 60: 515-21.
18. Shinohara T, Inoue K, Ogonuki N, et al: Birth of offspring following transplantation of cryopreserved immature testicular pieces and in-vitro microinsemination. Hum Reprod. 2002; 17: 3039-3045.
19. Reis, M.M., Tsai, M.C., Schlegel, P.N. et al: Xenogeneic transplantation of human spermatogonia. Zygote. 2000 (in press).
20. Reis, M.M., Schlegel, P.N. Takeuchi, T. et al: Xenogeneic transplantation of human spermatogonia. Gynecol. Endocrinol. 1999; 13 (Suppl. 3): 24.
21. Nagano M, Patrizio P, Brinster RL. Long-term survival of human spermatogonial stem cells in mouse testes. Fertil Steril. 2002; 78: 1225-33.
22. Brook PF, Radford JA, Shalet SM. et al: Isolation of germ cells from human testicular tissue for low temperature storage and autotransplantation. Fertil Steril. 2001; 75: 269-74.
23. Nagano M, Shinohara T, Avarbock R, Brinster RL. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 2000; 475: 7-10.
24. Nagano M, Avarbock MR, Brinster RL. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biol Reprod. 1999; 60: 1429-36.
25. Brinster, R.L. and Zimmermann, J.W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc. Natl Acad. Sci. 1994; 92: 11298-11302.
26. Clouthier, D.E., Avarbock, M.R., Maika, S.D. et al: Rat spermatogenesis in mouse testis. Nature. 1996; 381: 30.
27. Schlatt, S., Rosiepen, G., Weinbauer, G.F. et al. Germ cell transfer into rat, bovine, monkey and human testes. Hum. Reprod. 1999; 14: 144-150.
28. Lee DR, Kim KS, Yang YH, et al: Isolation of male germ stem cell-like cells from testicular tissue of non-obstructive azoospermic patients and differentiation into haploid male germ cells in vitro. Hum Reprod. 2006; 21: 471-6.
29. Tycko, B., Trasler, J. and Bestor, T. Genomic imprinting: Gametic mechanisms and somatic consequences. J. Androl. 1997; 18: 480-486.
30. Park HJ, Yoo JJ, Kershen RT, et al: Reconstitution of human corporal smooth muscle and endothelial cells in vivo. J Urol. 1999; 162: 1106-9.
31. Kwon TG, Yoo JJ, Atala A. Autologous penile corpora cavernosa replacement using tissue engineering techniques. J Urol. 2002; 168: 1754-8.
32. Champion HC, Bivalacqua TJ, Hyman AL, et al: Gene transfer of endothelial nitric oxide synthase to the penis augments erectile responses in the aged rat. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 11648-52.
33. Bivalacqua TJ, Champion HC, Abdel-Mageed AB, et a: Gene transfer of prepro-calcitonin gene-related peptide restores erectile function in the aged rat. Biol Reprod. 2001; 65: 1371-7.
34. Chancellor MB, Tirney S, Mattes CE, et al: Nitric oxide synthase gene transfer for erectile dysfunction in a rat model. BJU Int. 2003; 91: 691-6.
35. Asakura A, Seale P, Girgis-Gabardo A, Rudnicki MA. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 2002; 159: 123-34.
36. Griese DP, Ehsan A, Melo LG, et al: Isolation and transplantation of autologous circulating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts: implications for cell-based vascular therapy. Circulation. 2003; 108: 2710-5.
37. Wessells H, Williams SK. Endothelial cell transplantation into the corpus cavernosum: moving towards cell-based gene therapy. J Urol. 1999; 162: 2162-4.
38. Foresta C, Caretta N, Lana A, et al: Circulating endothelial progenitor cells in subjects with erectile dysfunction. Int J Impot Res. 2005; 17: 288-90.
39. Pilatz A, Schultheiss D, Gabouev AI, et al: Isolation of primary endothelial and stromal cell cultures of the corpus cavernosum penis for basic research and tissue engineering. Eur Urol. 2005; 47: 710-8.
